壬基酚圍產期暴露對子代大鼠的肝毒性及機制探討

何麗婷，高鳳，俞捷，王攀，張恒，許潔

(1遵義醫學院公共衛生學院，貴州遵義563000;2遵義醫學院附屬醫院;3遵義市第一人民醫院)

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壬基酚圍產期暴露對子代大鼠的肝毒性及機制探討

何麗婷1，高鳳1，俞捷1，王攀2，張恒3，許潔1

(1遵義醫學院公共衛生學院，貴州遵義563000;2遵義醫學院附屬醫院;3遵義市第一人民醫院)

目的觀察壬基酚(NP)圍產期暴露對子代大鼠的肝毒性，并探討其可能的機制。方法 將成功交配的32只孕鼠隨機分為4組，每組8只，NP低、中、高劑量組分別予以NP 50、100、200 mg/kg加玉米油灌胃，對照組予以等容量玉米油灌胃；單籠飼養，空腹灌胃自受孕第6天起至生產后第21天止。仔鼠出生第60天麻醉后內眥取血，剖取肝臟；電鏡觀察肝細胞超微結構，免疫組化法檢測肝組織腫瘤壞死因子α(TNF-α)，高效液相法色譜法檢測血清NP。結果 NP低、中、高劑量組仔鼠肝細胞核內染色質聚集，核膜深染，胞質中有大量的脂滴，且大部分脂滴與溶酶結合，染色較深，且劑量越高表現越明顯。仔鼠肝組織TNF-α陽性表達的積分光密度、血清NP水平對照組

壬基酚；圍產期暴露；子代大鼠；肝毒性；腫瘤壞死因子α

壬基酚(NP)是一類具有模擬雌激素并與體內雌激素受體結合而干擾機體內分泌代謝，導致健康危害效應的環境內分泌干擾物(EEDs)。目前研究顯示，NP能對生物體產生廣泛的不良作用，包括生殖和發育[1]、心血管系統和神經系統[2]等。有研究表明，NP被攝入后主要經肝臟清除，肝臟可能是NP作用的主要靶器官[3，4]，并造成肝臟微細解剖結構的損傷[5]，同時可能對仔鼠的肝臟有毒性作用[6],但目前有關NP的肝毒性機制研究較少。腫瘤壞死因子α(TNF-α)是一種具有廣泛生物學功能的細胞因子，肝細胞表面含有豐富的TNF-α受體[7]，TNF-α與肝臟炎癥活動性及肝細胞壞死程度密切相關[8]。2015年5～12月，我們檢測了NP圍產期暴露大鼠仔鼠肝臟組織中TNF-α的表達，分析其與血清NP水平的相關性，初步探索NP肝毒性的機制。

1　材料與方法

1.1材料清潔級SD雌性大鼠32只，動物合格證號：SCXK(渝)20070005；99% NP(東京化成株式會社)，精制花生油(山東魯花牌)；TNF-α一抗為兔抗鼠親和純化抗體、兔抗鼠TNF-α多克隆抗體、二抗羊抗兔IgG抗體(北京中杉金橋生物科技有限公司)；正己烷-乙醚提取劑(體積比7∶3)，氯仿，異丁醇，75%乙醇等實驗室常備試劑均為國產分析純。高效液相色譜儀(Agilent 1100)；色譜柱：Eclipse XD8-CI8、150 mm×460 mm、5 μm石蠟切片機(美國Agilent公司)；普通光學/熒光顯微成像系統(德國徠卡公司)。

1.2分組與處理將32只大鼠成功交配后隨機分為4組，每組8只；NP低、中、高劑量組分別予以NP 50、100、200 mg/kg加玉米油 5 mL/kg灌胃，對照組予以等容量玉米油灌胃；單籠飼養，空腹灌胃自受孕第6天起至生產后第21天止。仔鼠出生后常規哺乳喂養，哺乳期后常規飼養。

1.3指標觀察仔鼠出生第60天麻醉后內眥取血，剖取肝臟。取部分肝臟組織行鈾鉛雙染色，電鏡下觀察肝細胞超微結構。常規制作肝組織石蠟切片，采用免疫組化法檢測肝組織TNF-α表達，按試劑盒說明書操作。以胞質中出現棕黃色顆粒為TNF-α陽性細胞。每張切片在10×40倍顯微鏡下選取肝臟視野，采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件測量TNF-α陽性表達的積分光密度(IOD)值。取血常規離心取血清，高效液相色譜法檢測血清NP水平。

1.4 統計學方法采用SPSS22.0統計軟件。各組間比較用單因素方差分析，兩兩比較行SNK檢驗；相關性分析采用Pearson分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組仔鼠肝細胞超微結構比較對照組仔鼠肝細胞核大而圓，核膜清晰，核內染色質均勻分布，胞質中細胞器形態正常，且分布均勻，有少量脂滴存在。NP低、中、高劑量組仔鼠肝細胞核內染色質聚集，核膜深染，胞質中有大量的脂滴，且大部分脂滴與溶酶結合，染色較深，且劑量越高表現越明顯。

2.2各組仔鼠肝臟組織TNF-α表達量比較NP低、中、高劑量組仔鼠肝臟組織TNF-α表達的IOD值分別為1 738.99±52.57、2 509.81±32.55、3 096.15±54.01，均高于對照組的79.91±14.72(P均<0.01)；并且NP劑量越高，仔鼠肝臟組織TNF-α表達的IOD值越高(P均<0.01)。

2.3 各組仔鼠血清NP水平比較NP低、中、高劑量組仔鼠血清NP水平分別為(0.43±0.01)、(1.36±0.08)、(2.00±0.30)μg/mL，均高于對照組的(0.04±0.00)μg/mL(P均<0.01)；并且NP劑量越高，仔鼠血清NP水平越高(P均<0.01)。

2.4仔鼠肝臟組織TNF-α表達量與血清NP水平的關系相關分析顯示，仔鼠肝臟組織TNF-α表達量與血清NP水平呈正相關(r=0.92,P<0.01)。

3　討論

NP作為一種表面活性劑，被運用于化工業、農業等數十領域。研究表明，NP是一種具有全身毒性的EEDs[9，10]，具有明顯的生物累積性，在水生動物肝臟的蓄積系數達到40～100倍。馬全祥等[5]研究表明，小鼠自由飲用1% NP溶液第10天后，光鏡下可見小鼠肝臟肝小葉內出現明顯灶狀壞死，并有炎癥浸潤，但對其所致肝臟毒性機制的研究較少。

TNF-α是一種具有廣泛生物學功能的多肽類細胞因子，參與內毒性休克、炎癥、免疫調節、細胞增生、細胞毒性和抗病毒等過程。TNF-α作為炎性反應的始動因子，能在細胞核亞細胞水平上激發一系列級聯或瀑布效應，誘導TNF-α等多種炎癥因子的上調[11～14]。肝細胞受損后可產生大量的抗原應答反應，使單核細胞、巨噬細胞等被激活，從而分泌大量的TNF-α，與肝細胞上TNF-α受體結合損傷肝細胞。TNF-α還與肝血竇內皮細胞上的受體結合，促使中性粒細胞的趨化和脫顆粒，進一步導致肝損傷。本研究結果顯示，NP低、中、高劑量組仔鼠肝細胞核內染色質聚集，核膜深染，胞質中有大量的脂滴，且大部分脂滴與溶酶結合，染色較深，且劑量越高表現越明顯。說明圍產期行NP暴露可對仔鼠產生肝毒性。仔鼠肝組織TNF-α、血清NP水平對照組

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國家自然科學基金資助項目(81360439，81560527)；貴州省教育廳青年基金(黔教合KY字2013-198)；貴州省科技廳聯合基金(黔科合LH字2014-7543)；貴州省大學生創新基金(2016)；遵義醫學院招標課題(2013F-68，2015F-784)；遵義醫學院大學生創新基金(20155011)。

許潔(E-mail: xujie360@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.34.009

R575.1

A

1002-266X(2016)34-0025-03

2015-12-24)