回神顆粒減輕中度創傷性腦損傷大鼠腦內炎性反應的機制

崔俊波指導：陳寶貴（1中國中醫科學院博士后科研流動站，北京，100700；天津中醫藥大學附屬武清中醫院，天津，301700）

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回神顆粒減輕中度創傷性腦損傷大鼠腦內炎性反應的機制

崔俊波1，2指導：陳寶貴2
（1中國中醫科學院博士后科研流動站，北京，100700；2天津中醫藥大學附屬武清中醫院，天津，301700）

摘要目的：探討回神顆粒減輕中度創傷性腦損傷（Traumatic Brain Injury，TBI）后腦內炎性反應的作用環節。方法：應用液壓性腦損傷裝置建立中度TBI模型，創傷壓力為（170±10）kPa，作用時間為（20±2）ms，隨機將大鼠分為6組：正常組、假手術組、模型3 d組、模型7 d組、治療3 d組、治療7 d組。治療3 d組和治療7 d組于創傷后即刻用2 mL藥液（含回神顆粒0. 27 g）灌胃1次，此后再分別于每日早晚各灌胃1次，每次2 mL藥液。采用RT-PCR檢測6組動物損傷區腦組織內ICAM-1的變化。結果：與正常組比較：模型3 d組、模型7 d組、治療3 d組ICAM-1的表達明顯升高，具有統計學意義（P ＜0. 01）；治療7 d組ICAM-1的表達的升高無統計學意義（P＞0. 05）。治療3 d組ICAM-1的表達較模型3 d組明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0. 05）；治療7 d組ICAM-1的表達與模型7 d組比較，差異具有統計學意義（P＜0. 05）。結論：回神顆粒通過從轉錄水平抑制ICAM-1的表達，進而減輕腦內炎性反應，避免TBI后腦損傷的進一步加重。

關鍵詞創傷性腦損傷；繼發性腦損傷；腦內炎性反應；中性粒細胞；細胞間黏附分子-1；回神顆粒

The Mechanism of Huishen Granule Alleviating Intracerebral Inflammatory Response on Moderate Traumatic Brain Rats

Cui Junbo1，2，Chen Baogui2
（1 Post Doctoral Research Station in Chinese Academy of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100700，China；2 Wu Qing TCM Hospital Affiliated to Tianjin University of TCM，Tianjin 301700，China）

Abstract Objective：This research aims to investigate the mechanism of Huishen Granule alleviating intracerebral inflammatory response in rats with traumatic injury injury（TBI）. Methods：Using the equipment of fluid percussion injury（FPI）to establish moderate FPI model in SD rats. The traumatic pressure was（170±10）kPa，traumatic time was（20±2）ms. Randomly divided rats into 6 groups：normal group，sham group，model 3 day group，model 7 day group，experimental 3 day group，experimental 7 day group. Experimental 3 day group and experimental 7 day group were given 2 mL fluid（contain 0. 27 g Huishen Granule）into rats'stomach instantly after trauma，and then given 2 mL fluid in the morning and at night. Using real-time polymerization chain reaction（RT-PCR）to examine the change of ICAM-1 in all 6 groups. Results：Compared with normal group，the ICAM-1 of model 3 day group，model 7 day group and experimental 3 day group increased obviously（P＜0. 01）. However，compared with model 3 day group，the ICAM-1 of experimental 3 day group descended significantly（P＜0. 05）. Compared with model 7 day group，the ICAM-1 of experimental 7 day group declined obviously（P＜0. 05）. Conclusion：The mechanism of Huishen Granule alleviating intracerebral inflammatory response was through prohibiting the expression of ICAM-1 and avoid aggravation of TBI.

Key Words Traumatic brain injury；Secondary brain injury；Intracerebral inflammatory response；Polymorphonuclear leukocyte；ICAM-1；Huishengranule

腦內炎性損傷在創傷性腦損傷（Traumatic Brain Injury，TBI）后繼發性腦損傷（Secondary Brain Injury，SBI）發展中的作用受到重視，炎性反應參與腦創傷后SBI及損傷修復階段。TBI后腦內炎性反應的特征表現為腦內中性粒細胞的出現、聚集和浸潤［1］。但由于血腦屏障的存在，循環中的中性粒細胞聚集和浸潤到損傷灶的腦組織內，首先必須中性粒細胞黏附到血管內皮，而這個過程需要黏附分子細胞間黏附分子（Intercellular Adhesion Molecule，ICAM）的表達上調［2］。故ICAM-1水平是評價顱腦損傷早期炎性反應損傷程度的重要指標，其變化水平與傷情嚴重程度密切相關［3］。本實驗采用中度TBI大鼠模型，觀察回神顆粒對中度TBI后ICAM-1含量的影響，探討回神顆粒減輕腦內炎性反應，避免TBI后腦損傷加重的作用環節。

1　材料與方法

1. 1 動物來源及分組 SPF級、雄性SD大鼠50只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證編號：SCXK（京）2002-0003。體重（320±10）g，實驗大鼠于動物室內分開籠中喂養，室內溫度為（17 ±3）℃，濕度為（50±20）%，每日光照12 h，并提供約50 g全營養鼠糧及足量清潔飲水。SPSS軟件隨機分為6組：正常組和假手術組各7只；模型3 d組、模型7 d組、治療3 d組、治療7 d組均為每組9只。

1. 2 主要儀器和試劑 主要包括：液壓顱腦損傷裝置、動物立體定位頭架、熒光定量PCR擴增儀、凝膠圖像分析系統、熒光定量PCR主反應液、胎牛血清等試驗器材及耗材。

1. 3 顱腦創傷模型的制作 參照崔俊波［4］等文獻中方法，應用液壓性創傷性裝置（天津環湖醫院神經外科研究所提供），調整打擊錘角度至12度，則產生的壓力大小（170±10）kPa，作用時間為（20±2）ms，即可制作中度TBI模型，選取造模成功的動物進入試驗環節。

1. 4 實驗處理方法 治療組：依據回神顆粒（天津市武清區中醫醫院提供，制劑許可證號為：津XZ20010039）臨床應用劑量：3次／d×10 g／次＝30 g／d，則標準體重大鼠劑量為30 g／d×0. 018＝0. 54 g／d，用4 mL生理鹽水稀釋成藥液，并于創傷后即刻用2 mL藥液灌胃1次，其后再分別于每日早晚各灌胃1次，2 mL／次藥液。模型組：用4 mL生理鹽水，分早晚2次灌胃。

1. 5 取材時間及方法 模型3 d組、治療3 d組于損傷后3 d處死動物；假手術組、模型7 d組、治療7 d組于損傷后7 d處死動物；正常組動物處死時間同假手術組。每組各取6只動物取腦。取腦方法：大鼠取俯臥位，沿顱頂正中線從枕后部直至鼻尖切開大鼠頭皮，暴露大鼠顱骨。用拆線剪在枕后橫斷頸椎，從椎管內沿正中線向前剪開枕骨至后囟。再以拆線剪沿正中線剪開鼻骨、額骨至前囟，輕輕打開顱腔，暴露出大鼠腦組織。用剪刀輕輕將與腦組織相連的腦膜剪除。將鼠腦取出，選取損傷區腦組織約400 mg并立即投入液氮中，RT-PCR檢測時使用。

1. 6 RT-PCR檢測ICAM-1及標準曲線的制備［5］取無菌留取的大鼠腦組織100 mg以Trizol一步法提取總RNA，采用熒光定量RT-PCR技術對逆轉錄擴增產物進行定量分析。PRMER5. 0設計ICAM-1的引物序列，5'-GTGGGCAAGAACCTCATCCT 3'（正義鏈），5'-CTGGCGGCTCAGTGTCTCATT-3'（反義鏈），擴增片斷約103 bp。在延仲過程中搜集熒光信號，于每次擴增的同時設置無cDNA的陰性對照。結果由FTC-2000型熒光定量RT-PCR儀（上海，楓嶺生物技術有限公司）自帶分析軟件進行分析。將ICAM-1的PCR擴增片段回收，連接于PMD-18T載體，轉化DH5α感受態細胞中，培養后再PCR鑒定，大量培養含陽性片段的重組克隆，減法提取重組質粒并純化，測OD值計算濃度，并進行倍比稀釋的熒光定量PCR，最終確定ICAM-1的標準曲線。

1. 7 統計學方法及數據處理 統計學處理使用SPSS 11. 5統計軟件。ICAM-1以均數±標準差（± s）表示。ICAM-1的2組間差異顯著性采用2個獨立樣本t檢驗。以P＜0. 05作為有無統計學意義的界限。

2　結果

2. 1 ICAM-1的擴增曲線、融解曲線、標準曲線 見圖1 -圖3。

圖1　ICAM-1的擴增曲線

圖2　ICAM-1的融解曲線

2. 2 ICAM-1的數值結果 與正常組比較：模型3 d組、模型7 d組、治療3 d組ICAM-1的表達明顯升高，具有統計學意義（P＜0. 01）；治療7 d組ICAM-1的表達的升高無統計學意義（P＞0. 05）。治療3 d 組ICAM-1的表達較模型3 d組明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0. 05）；治療7 d組ICAM-1的表達與模型7 d組比較，差異具有統計學意義（P＜0. 05）。

圖3　ICAM-1的標準曲線

表1　補氣化瘀開竅法對TBI大鼠ICAM-1mRNA的影響

3　討論

ICAM-1又稱CD54，是黏附分子免疫球蛋白超家族中的一種單鏈跨膜糖蛋白。正常情況下中樞神經系統中，包括腦血管內皮細胞的表達的水平很低，但在神經疾病中，由于多種炎性反應遞質和細胞因子以及應激反應、缺氧和缺血再灌注等因素刺激下，ICAM-1表達明顯升高［6］。Knoblach等［7］通過大鼠尾靜脈注射抗ICAM-1的抗體可以減輕外傷性炎性反應，減少中性粒細胞的活性，促進運動功能恢復。劉剛［8］等發現大鼠顱腦損傷后ICAM1表達隨時間變化，很可能在顱腦損傷修復中發揮重要功能，且對顱腦損傷的早期判定具有重要意義。本實驗發現兩個模型組及治療3 d組損傷區腦組織中的ICAM-1mRNA表達量均較正常組顯著增加（P＜0. 01），但兩個治療組損傷區腦組織中的ICAM-1mRNA表達量均明顯低于相對應的模型組（P＜0. 05），且經過應用回神顆粒治療7 d后，治療7 d組損傷區腦組織中的ICAM-1mRNA表達量明顯降低，與正常組比較無顯著增加（P＜0. 01）。顯示TBI后早期應用回神顆粒導致損傷區腦組織中ICAM-1mRNA水平的表達顯著減少，表明回神顆粒能從轉錄水平抑制ICAM-1的表達，進而減輕腦內炎性反應，避免TBI后腦損傷的進一步加重。

現代藥理研究表明［9］：丹參能夠明顯改善微循環，加速血流；川芎在體外對由膠原和凝血酶誘導的家兔血小板聚集有顯著抑制作用，并可使已聚集的血小板迅速解聚，進而阻止中性粒細胞堵塞微血管，避免血栓形成；五味子酚可使大鼠中性粒細胞表面的偽足和皺褶消失，減少中性粒細胞在內皮細胞的附著和浸潤，而具有調節中性粒細胞功能的作用。既往研究證實回神顆粒能夠提高腦缺血大鼠模型腦組織SOD含量，降低MDA含量而減輕自由基對腦細胞的損害。故回神顆粒減輕TBI后損傷區腦組織中的炎性反應所介導的SBI的機制可能包括：1）降低傷灶區腦組織中ICAM-1mRNA水平的表達，進而減少傷灶區腦組織中的中性粒細胞的積聚和浸潤；2）改善微循環，阻止ICAM-1激活的中性粒細胞堵塞微血管，避免血栓形成；3）減輕ICAM-1激活的中性粒細胞釋放的大量自由基導致的腦損害。

參考文獻

［1］Becker KJ. Targeting the central nervous system inflammatory response in ischemic stroke［J］. Curr Opin Neurol，2001，14（3）：349-353.

［2］Whalen MJ，Carlos TM，Dixon CE，et al. Reduced brain edima after traumatic brain injury in mice deficient in P-selectin and intercellular adhesion molecule-1［J］. Leukoc Biol，2000，67（2）：160-168.

［3］楊夢心，何柯新，麥靜雯.顱腦損傷患者血清3項水平的變化及意義［J］.檢驗醫學與臨床，2014，11（13）：1813-1815.

［4］崔俊波，梁建偉，陳寶貴.中度液壓性創傷性腦損傷模型的建立與評估［J］.時珍國醫國藥，2009，20（9）：2375-2376.

［5］王翀，朱賢立，趙洪洋，等.細胞黏附分子（ICAM-1）在大鼠彌漫性腦損傷中的表達意義［J］.中國微侵襲神經外科雜志，2006，11 （2）：71-74.

［6］Isaksson J，Lewen A，Hillered L，et al. Up-regulation of intercellular adhesion molecular 1 in cerebral microvessels after cortical contusion trauma in a rat model［J］. Acta Neuropathol（Berl），1997，94（1）：16-20.

［7］Knoblach SM，FadenAI. Administration of either anti-intercellular adhesion molecule-1 or a nonspecific control antibody improves recovery after traumatic brain injury in the rat［J］. Neurotrauma，2002，30 （19）：1039-1050.

［8］劉剛，李暢，任強，等.大鼠顱腦損傷后ICAM-1在神經細胞中表達譜及其意義［J］.中國老年學雜志，2014，34（22）：6425-6426.

［9］國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草精選本［M］.上海：上海科學技術出版社，1998：10，169-179，2194-2200，2522-2525.

（2015 -06 -30收稿 責任編輯：王明）

針灸經絡

中圖分類號：R285. 5

文獻標識碼：A

doi：10. 3969／j. issn. 1673 -7202. 2016. 03. 036

作者簡介：崔俊波（1976—），男，漢族，河南鄭州人，醫學博士，全國首批中醫藥傳承在站博士后，天津市“131”創新型人才培養工程第一層次人選，副主任醫師，碩士研究生導師，陳寶貴名中醫工作室主任，研究方向：中西醫結合治療腦病研究及名中醫學術經驗繼承應用工作，Tel：（022）29338845轉7906，E-mail：clevertwins＠163. com

基金項目：全國名老中醫傳承工作室建設項目［編號：國中醫藥人教發（2011）41］；全國中醫藥傳承博士后資助項目［編號：國中醫藥人教函（2013）240號］；天津市“131”創新型人才第一層次人選培養工程［編號：津人才（2013）9］