護卵顆粒對重復制動應激致卵巢功能減退模型大鼠的影響

黃雪君孫冬梅陳玉興甘海寧黃 琳趙靜宇（廣東省中醫藥工程技術研究院，廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣州，50095；廣州中醫藥大學，廣州，50006）

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護卵顆粒對重復制動應激致卵巢功能減退模型大鼠的影響

黃雪君1孫冬梅1陳玉興1甘海寧1黃 琳2趙靜宇2
（1廣東省中醫藥工程技術研究院，廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣州，510095；2廣州中醫藥大學，廣州，510006）

摘要目的：觀察護卵顆粒對重復制動應激致大鼠卵巢功能減退的治療作用。方法：模型組采用性周期規律的雌性SD大鼠置于特制的束縛制動筒內，固定身體使之不能隨意活動，制動應激1次／d，連續15 d建立卵巢早衰大鼠模型，每天陰道圖片觀察大鼠動情周期變化，造模成功后分為6組：模型對照組、補佳樂組、調經促孕丸組及護卵顆粒高、中、低劑量組，另取10只作為空白對照組，連續給藥4周。給藥結束后經開野行為測定后腹主動脈采血，冰臺上取大鼠下丘腦，留取卵巢組織標本。測定血清雌二醇（Estradiol in serum，E2）、促卵泡激素（Follicle-stimulating Hormone，FSH）、黃體生成素（Luteinizing Hormone LH）、孕酮（Progesterone，PROG）水平及檢測下丘腦多巴胺（Dopamine，DA）、去甲腎上腺素（Noradrenaline，NA）、五羥色胺（Hydroxytryptamine，5-HT）含量，觀察卵巢濕重變化及組織學改變。結果：護卵顆粒各劑量組能明顯提高重復制動應激致卵巢早衰大鼠的水平和垂直活動得分，能提高卵巢早衰大鼠血清E2、PROG水平和降低FSH、LH水平，降低卵巢早衰大鼠下丘腦DA、NA及5-HT含量，與模型組比較差異均有統計學意義（P＜0. 05或P＜0. 01）。與模型組比較，護卵顆粒高、中劑量組大鼠卵巢內各級卵泡數增多，卵巢指數增加。結論：護卵顆粒可以提高卵巢功能減退模型大鼠水平活動和垂直活動，增加E2、PROG及NA的分泌，增加卵巢指數，促進卵巢功能減退大鼠的卵泡生長，恢復受損卵巢的內分泌功能。

關鍵詞護卵顆粒；卵巢功能減退；重復制動應激；開野行為

Effect of HuLuanKeLi on Diminished Ovarian Reserve Rats with Repeated Immobilization Stress

Huang Xuejun1，Sun Dongmei1，Chen Yuxing1，Gan Haining1，Huang Lin2，Zhao Jingyu2
（1 Guangdong Research Institute of Traditional Chinese Medicine（TCM）Manufacturing Technology，Guangdong Province Key Laboratory of TCM Research and Development，Guangzhou 510095，China；2 Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China）

Abstract Objective：To observe the effects of HuLuanKeLi on diminished ovarian reserve in rats of repeated immobilization. Methods：The adult female rats with regular cycle in model group were exposed to the scheduled daily repeated immobilization for 15 days，one time per day. The duration of immobilization was progressively increased with the subsequent episode. Daily vaginal smears were permfored to follow the estrous cycle in rats. After molding，60 rats were subdivided into 6 groups（n ＝10）：Model group，BuJiaLe group，TiaoJingCuYunWan group，high-dose、middle-dose and low-dose group，treated for 4 weeks respectively. After Openfield testing，blood samples were obtained from abdominalaorta，and samples of ovarian tissues were harvested. Serum levels of Estradiol（E2），Follicle-stmiulating hormone（FSH），Luteinizing hormone（LH），Progesterone（PROG）and hypothalamus content of Dopamine（DA），Norepinephrine（NA），Serotonin（5-HT）were measured by ELISA，and the changes of wet weight and histology of ovary were observed. Results：Compared with the model group，HuLuanKeLi increased serum level of E2，PROG and decreased FSH，LH；and decreased hypothalamus content of DA，NA，5-HT（P＜0. 05or P＜0. 01）；and the wet weight of ovary increased in each dose of HuLuanKeLi groups. Conclusion：HuLuanKeLi can promote follicle growth in rats with premature ovarian failure，increase secretion of ovarian E2，PROG，and improve endocrine function of damaged ovaries.

Key Words HuLuanKeLi；premature ovarian failure；repeated immobilization；openfield

卵巢產生卵子能力減弱，卵泡質量下降，導致女性生育能力下降及性激素的缺乏，稱卵巢功能減退即卵巢儲備功能下降（Diminished Ovarian Reserve， DOR）。DOR臨床表現可無癥狀，或僅表現為生育力的下降，或輕微的月經改變等，若患者診斷不及時而延誤治療，容易發展為卵巢早衰（Premature Ovari-an Failure，POF），而增加了治療的難度。中醫的“肝”是機體調節心理應激反應的核心，在心理應激的狀態下，最先受到影響的是人體的氣機，中醫肝主疏泄與心理應激狀態下導致的神經內分泌紊亂、免疫功能異常等密切相關。肝氣郁結證是主要中醫證型之一，中醫藥治療已經取得較好的療效，而且副作用小［1-3］。

護卵顆粒（加減益經顆粒）是由加減益經湯經現代工藝制成的中成藥制劑。護卵顆粒是根據《傅青主女科》的學術思想，在益經湯的基礎上加減而成，應用于DOR患者，取得了較好的療效。它由熟地黃、菟絲子、當歸、丹參、黨參、柴胡、白芍等中藥組成，方中以熟地黃、菟絲子、杜仲補腎之陰陽，柴胡調達肝氣以實肝用，當歸白芍補血養肝以養肝陰，全方補腎疏肝兼以活血健脾。本實驗通過建立重復制動應激致肝郁型卵巢功能減退大鼠模型，觀察護卵顆粒對卵巢功能減退大鼠的治療作用，為臨床治療提供實驗依據。

1　資料與方法

1. 1 一般資料

1. 1. 1 藥物 護卵顆粒（加減益經顆粒），由廣東省中醫研究所制劑實驗室提供，批號為131003。戊酸雌二醇片（補佳樂），法國DELPHARM Lille S. A. S公司產品，批號251A2。調經促孕丸，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號2035224。

1. 1. 2 動物 SPF級雌性SD大鼠，體重180～220 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，實驗生產合格證號和動物合格證號分別為SCXK（粵）2008-0002 和NO 44007200010888。實驗設施使用許可證號：SYXK（粵）2010-0059。

1. 1. 3 試劑 ELISA Kit for Rat E2，Batch No. 1406251；ELISA Kit for Rat FSH，Batch No. 1406251；ELISA Kit for Rat LH，Batch No. 1407252；ELISA Kit for Rat PROG，Batch No. 1407261；ELISA Kit for Rat Dopamine，Batch No. 1407181；ELISA Kit for Rat NA，Batch No. 1407101；ELISA Kit for Rat Serotonin，Batch No. 1407271；以上均為上海西唐生物科技有限公司產品。

1. 1. 4 儀器 JJ3000動物電子稱，G＆G公司產品；BS224S萬分之一電子天平，德國SARTORIUS產品；Bio-RAD 680酶標儀，美國伯樂公司產品；YD-AB型攤烘烤片機，YD62型石蠟包埋機，YD-6L型智能冰凍包埋機，浙江金華益迪產品；Leica RM2235輪式切片機，Leica TP 1020型全自動脫水機，德國萊卡公司產品；Shandon Gemini染色機，德國Thermo公司產品；DHG-9203型電熱恒溫干燥鼓風干燥箱，上海精密實驗設備廠產品；Olympus DP2-BSW型病理圖像采集系統，日本奧林巴斯公司產品。

1. 2 方法

1. 2. 1 劑量設置 劑量換算方法參考《中藥藥理研究方法學》“體表面積比”換算動物等效劑量［4］。護卵顆粒：臨床日用量65. 50 g生藥，大鼠等效劑量為5. 895 g生藥／kg，設為中劑量。高、中、低劑量組分別對應護卵顆粒11. 790 g生藥／kg、5. 895 g生藥／kg、2. 9475 g生藥／kg。戊酸雌二醇片：臨床日用量1 mg，大鼠等效劑量為0. 09 mg／kg。調經促孕丸：臨床日用量10 g，大鼠等效劑量為0. 9 g／kg。

1. 2. 2 造模方法 SD大鼠適應性喂養1周后，行陰道脫落細胞涂片檢查，1次／d，連續10 d，篩選出動情期為4～5 d，并連續出現2個動情周期的大鼠。將有規律性周期的雌性大鼠取10只作為空白組，其余大鼠為模型組，按照文獻方法［5-6］，應激時間安排在9：00 AM～5：00 PM之間，大鼠置于特制的束縛制動筒內，固定身體與尾部，使之不能隨意活動，制動應激1次／d，連續15 d，第1～3天每天制動應激2 h，以后每3 d延長應激時間1 h。

1. 2. 3 分組及給藥 應激結束后大鼠取血測定血清E2含量，以低于180 pg／mL為造模成功，除空白組10只大鼠外，取造模成功大鼠60只隨機分為6組，分別為模型組、補佳樂組、調經促孕丸組及護卵顆粒高、中、低劑量組，每組10只。護卵顆粒各劑量組及補佳樂、調經促孕丸組大鼠按劑量灌胃給藥，10 mL／kg，1次／d，連續4周，空白組、模型組大鼠給予等體積蒸餾水。

1. 2. 4 檢測指標 1）陰道脫落細胞檢查［7］：開始造模后，每天進行大鼠陰道細胞學涂片蘇木素伊紅染色后鏡檢觀察其動情周期變化。2）開野行為測定（Open-field）［8］：在方形木箱（80 cm×80 cm×40 cm）進行，周壁為黑色，底面分為均勻的方格。實驗時在安靜的房間將大鼠放在木箱正中，以大鼠三爪以上跨入鄰格的次數為水平活動得分，兩前肢離地或攀附墻壁1 cm以上的次數為垂直活動得分。每只大鼠每次測定時間為5 min，徹底清潔木箱后觀察下一大鼠。3）血清指標檢測：大鼠腹主動脈取血，分離血清，血清置于-20℃保存待測。以酶聯免疫法測定大鼠血清中E2、FSH、LH、PROG水平的變化。4）神經遞質的檢測：斷頭處死大鼠，冰臺上打開顱腔，取下丘腦，液氮速凍后入低溫冰箱保存。生理鹽水研磨10%勻漿，酶聯免疫法檢測下丘腦DA、NA、5-HT含量。5）卵巢稱重：完整取出大鼠卵巢及子宮，去掉筋膜及脂肪組織，電子天平稱重，將稱得的卵巢濕重、子宮濕重分別除以體重，按以下公式計算：卵巢指數＝卵巢濕重（mg）／體重（g）×100%，子宮指數＝子宮濕重（mg）／體重（g）×100%。6）卵巢組織形態學觀察：稱重后置福爾馬林固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片，行組織形態學觀察。

1. 2. 5 統計學方法 所有計量資料以均數加減標準差（±s）表示。多組間均數的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間均數兩兩比較，方差齊時采用SNK法；方差不齊時采用Dunnett's T3法。由SPSS 15. 0軟件完成。

2　結果

2. 1 對大鼠動情周期的影響 通過陰道涂片觀察所得，各大鼠造模前動情周期變化規律，周期約4～5 d。除空白對照組外其余各組大鼠自身免疫造模后大鼠出現動情周期改變，停止于動情間期；空白對照組仍有規律的動情周期。模型對照組造模后4周內動情周期紊亂；補佳樂組、護卵顆粒高、中劑量組給藥后14～15 d出現完整的動情周期；低劑量組給藥后19～20 d左右開始出現動情前期，持續8～10 d，至給藥4周結束前出現動情期；調經促孕丸組給藥后15～17 d出現動情周期，周期時間延長。

2. 2 對重復制動應激大鼠開野行為的影響 由表1可見，各組大鼠Open-Field法測定水平活動，與空白對照組相比，模型對照組的大鼠水平活動得分顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0. 01），護卵顆粒高、中、低劑量組與補佳樂組、調經促孕丸組大鼠水平活動得分明顯高于模型對照組，差異有統計學意義（P＜0. 05或P＜0. 01）。

各組大鼠Open-Field法測定垂直活動，與空白對照組相比，模型對照組的大鼠水平活動得分顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0. 01），護卵顆粒高劑量組與調經促孕丸組大鼠垂直活動得分明顯高于模型對照組，差異有統計學意義（P＜0. 05或P ＜0. 01）。

2. 3 對大鼠血清E2、FSH、LH、PROG的影響 由表2可知，給藥4周后，模型對照組大鼠E2及PROG與空白對照組比較明顯降低，護卵顆粒各劑量組與補佳樂組、調經促孕丸組大鼠E2及PROG與模型對照組比較顯著增加，差異有統計學意義（P＜0. 05或P ＜0. 01）。模型對照組大鼠FSH、LH與空白對照組比較明顯增高，護卵顆粒各劑量組與補佳樂組、調經促孕丸組大鼠FSH與模型對照組比較顯著降低，差異有統計學意義（P＜0. 01），護卵顆粒各劑量組大鼠LH與模型對照組比較顯著降低，差異有統計學意義（P＜0. 05）。

2. 4 對大鼠垂體DA、NA、5-HT的影響 由表3可知，給藥4周后，模型對照組大鼠DA、NA、5-HT與空白對照組比較明顯增高，護卵顆粒高劑量組與補佳樂組大鼠DA與模型對照組比較顯著降低，差異有統計學意義（P＜0. 01），護卵顆粒高、中劑量組與補佳樂組、調經促孕丸組大鼠NA與模型對照組比較顯著降低，差異有統計學意義（P＜0. 01或P＜0. 05），護卵顆粒各劑量組與補佳樂組、調經促孕丸組大鼠5-HT與模型對照組比較顯著降低，差異有統計學意義（P＜0. 01或P＜0. 05）。

2. 5 對大鼠卵巢指數、子宮指數的影響 由表4可知，大鼠給藥4周后，模型對照組大鼠卵巢指數與空白對照組比較明顯下降，差異有統計學意義（P＜0. 01）。護卵顆粒各劑量組與補佳樂組、調經促孕丸組大鼠卵巢指數與模型組比較顯著增加，差異有統計學意義（P＜0. 05）。各給藥組與空白對照組及模型對照組比較差異無統計學意義（P＞0. 05）。

表1　護卵顆粒對重復制動應激大鼠水平活動、垂直活動的影響（±s，n＝10）

表1　護卵顆粒對重復制動應激大鼠水平活動、垂直活動的影響（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，*P＜0. 05，**P＜0. 01；與模型對照組比較，＃P＜0. 05，＃＃P＜0. 01。

組別　　劑量　　水平活動得分　　垂直活動得分空白對照組-69. 60±6. 69　32. 20±10. 23模型對照組　-　32. 00±7. 60**　13. 40±5. 50**補佳樂組　0. 09 mg／kg　41. 00±8. 41**＃　17. 60±4. 72**調經促孕丸組　0. 9 g／kg　53. 40±10. 97**＃＃　22. 60±8. 17*＃護卵顆粒高劑量組　11. 79 g／kg生藥　63. 70±11. 03＃＃　29. 60±5. 10＃＃護卵顆粒中劑量組　5. 895g／kg生藥　60. 30±13. 38＃＃　25. 10±9. 31＃＃護卵顆粒低劑量組　2. 9475 g／kg生藥　47. 80±10. 70**＃＃　21. 80±6. 48*＃

表2　護卵顆粒對卵巢功能減退模型大鼠E2、FSH、LH、PROG的影響（±s，n＝10）

表2　護卵顆粒對卵巢功能減退模型大鼠E2、FSH、LH、PROG的影響（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，*P＜0. 05，**P＜0. 01；與模型對照組比較，＃P＜0. 05，＃＃P＜0. 01。

組別　　劑量　E2（pg／mL）　FSH（ng／mL）　LH（ng空白對照組　-　273. 01±60. 72　1. 06±0. 52　1. 45±0模型對照組　-　116. 27±58. 82**　3. 76±0. 75**　4. 38±1補佳樂組　0. 09 mg／kg　210. 24±49. 68＃　2. 26±0. 58**＃＃　2. 46±0調經促孕丸組　0. 9 g／kg　181. 68±53. 30*＃　2. 82±0. 58**＃＃　2. 04±1護卵顆粒高劑量組　11. 79 g生藥／kg　 239. 25±91. 27＃＃　2. 35±0. 55**＃＃　1. 66±1護卵顆粒中劑量組　5. 895 g生藥／kg　 211. 68±73. 47＃　2. 39±0. 33**＃＃　1. 44±0護卵顆粒低劑量組　2. 9475 g生藥／kg　 198. 12±52. 64＃　2. 77±0. 41**＃＃　1. 60±0 ／mL）　PROG（ng／mL）. 60　424. 71±47. 85 . 92*　286. 19±79. 72**. 99　363. 76±69. 72＃. 06　377. 85±63. 50＃. 04＃　384. 69±75. 66＃. 53＃　367. 84±48. 56＃. 76＃　356. 80±83. 75＃

表3　護卵顆粒對卵巢功能減退模型大鼠DA、NA、5-HT的影響（±s，n＝10）

表3　護卵顆粒對卵巢功能減退模型大鼠DA、NA、5-HT的影響（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，*P＜0. 05，**P＜0. 01；與模型對照組比較，＃P＜0. 05，＃＃P＜0. 01。

組別　　劑量　DA（pg／mL）　NA（ng／mL）　5-HT（ng／mL）空白對照組-42. 42±10. 93　4. 88±1. 35　25. 94±3. 55模型對照組　-　87. 47±19. 69**　13. 66±3. 43**　50. 77±7. 69**補佳樂組　0. 09 mg／kg　45. 21±6. 88＃＃　5. 46±1. 64＃＃　34. 48±2. 34**＃＃調經促孕丸組　0. 9 g／kg　73. 97±17. 73**　8. 57±2. 47*＃　39. 88±6. 00**＃護卵顆粒高劑量組　11. 79 g生藥／kg　52. 32±11. 82＃＃　7. 66±1. 88*＃＃　34. 56±5. 54*＃＃護卵顆粒中劑量組　5. 895 g生藥／kg　64. 54±20. 08　7. 73±2. 72＃＃　37. 27±7. 00**＃護卵顆粒低劑量組　2. 9475 g生藥／kg　80. 90±22. 84**　10. 64±3. 61*　39. 64±5. 78**＃

表4　護卵顆粒對卵巢功能減退模型大鼠卵巢指數的影響（±s，n＝10）

表4　護卵顆粒對卵巢功能減退模型大鼠卵巢指數的影響（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，*P＜0. 05，**P＜0. 01；與模型對照組比較，＃P＜0. 05，＃＃P＜0. 01。

組別　　劑量　　卵巢指數mg／g%　　子宮指數mg／g%空白對照組-50. 70±3. 43　211. 84±64. 40模型對照組　-　39. 32±3. 63**　165. 59±38. 78補佳樂組　0. 09mg／kg　46. 96±6. 40＃　207. 08±60. 78調經促孕丸組　0. 9g／kg　45. 15±4. 67＃　196. 69±67. 04護卵顆粒高劑量組　11. 79g生藥／kg　47. 09±5. 13＃　202. 16±32. 55護卵顆粒中劑量組　5. 895g生藥／kg　46. 87±6. 51＃　195. 61±52. 41護卵顆粒低劑量組　2. 9475g生藥／kg　45. 24±5. 92＃175. 65±25. 15

圖1　護卵顆粒卵巢功能減退模型大鼠卵巢結構形態學影響（HE，×100）

2. 6 對大鼠卵巢結構形態學變化 空白對照組卵巢可見各級卵泡及黃體分布，形態正常，成熟卵泡體積較大，卵泡液較多。模型對照組卵巢生長卵泡減少，原始卵泡較多，黃體數量少，閉鎖卵泡多。補佳樂組與調經促孕丸組初級卵泡、生長卵泡增多，成熟卵泡可見。護卵顆粒高、中劑量組生長卵泡較模型對照組增多，出現較大直徑的卵泡，閉鎖卵泡減少。護卵顆粒低劑量組生長卵泡、成熟卵泡可見。結果見圖1。

3　討論

社會、心理因素對女性生殖健康的影響越來越受到關注，婦女易受身心應激的影響而導致月經失調閉經等婦科疾病發生。有調查研究心理因素是導致DOR及POF的中藥原因之一，且長期的社會心理壓力可能比短期的壓力更能影響卵巢的功能［9-10］。肝主謀慮，性喜條達而惡抑郁，肝健則情志調暢，肝與情志密切相關。陳修園在《婦科要旨·種子篇》中云：婦人無子，皆由經水不調，經水所以不調者，皆由內有七情之傷，外有六淫之感，或氣血偏盛，陰陽相乖所致。有學者提出心理應激從中醫臟象理論分析當主要責之于肝［11］，肝氣郁結證的客觀化研究也提示［12］，肝氣郁結證存在心理應激的障礙病理機制，涉及神經內分泌等調節網絡。軀體和心理應激均能在下丘腦-垂體-卵巢軸（Hypothalamicpituitary-ovarianaxis，HPO）水平抑制或損害女性卵巢功能，導致女性生殖內分泌功能紊亂或下降，甚至卵巢早衰。肝郁主要由應激產生的一系列神經內分泌的變化來體現的，尤其是HPO在卵巢內分泌活動的周期性變化調控中居關鍵地位，并可能以單胺類遞質的調節來實現在情志與生殖內分泌之間呈雙向調節作用。

本實驗采用重復制動應激建立肝郁型卵巢功能減退大鼠模型，慢性制動應激使動物自由行動受限，情緒受抑，比較接近中醫“情志不遂”的病因。模型組大鼠水平活動及垂直活動減少，動情周期紊亂，血清中E2、PROG的含量顯著降低，FSH、LH水平明顯升高，下丘腦DA、NA、5-HT含量升高，提示應激狀態下升高DA、NA、5-HT影響了中樞性腺對激素的分泌，引起了大鼠內分泌功能受損，說明造模成功。慢性應激能使大鼠活動減少，血清E2水平降低及FSH水平升高，能使大鼠卵巢各級卵泡數及黃體數減少［5，13-14］。在行為學研究中，曠場實驗常用來考察動物在新奇環境中的活動度、探究行為、恐懼緊張狀態及警覺性，肝郁證動物活動度明顯減少［15］。HPO軸應激性紊亂與下丘腦-垂體-腎上腺軸（Hypothalamic - pituitary - adrenal Axis，HPA）軸應激性亢進密切相關，心理應激能激活HPA軸，并在下丘腦、垂體、卵巢3個水平影響女性生殖內分泌功能［16］，而兒茶酚胺類和5-HT被認為是應激最重要的神經遞質［17-18］。FSH水平升高在卵巢功能下降時出現，它隨卵巢功能及受孕能力的降低而升高［19］。E2可能是比FSH更早反應卵巢功能下降的指標［20］。實驗結果表明，護卵顆粒各劑量組均能增加大鼠水平活動和垂直活動得分，明顯降低下丘腦DA、NA、5-HT含量，并明顯地升高DOR大鼠血清中E2、PROG的含量，降低FSH、LH水平，提示護卵顆粒可能通過參與調節HPO的內分泌功能，調節紊亂的單胺類遞質水平，促進卵巢分泌E2，抑制下丘腦和垂體FSH和LH的分泌。病理結果亦表明，護卵顆粒各劑量組生長卵泡數和成熟卵泡數增多，閉鎖卵泡明顯減少。

參考文獻

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（2015 -05 -13收稿 責任編輯：張文婷）

中圖分類號：R285. 5

文獻標識碼：A

doi：10. 3969／j. issn. 1673 -7202. 2016. 03. 035

通信作者：孫冬梅（1969—），女，碩士，博士生導師，主任中藥師，研究方向：從事中藥配方顆粒劑及中藥新藥研發，E-mail：tcmgdp＠163. com

作者簡介：黃雪君（1981—），女，博士，副主任中藥師，研究方向：從事中藥藥理及毒理研究，Tel：（020）83576735，E-mail：sharon510＠126. com

基金項目：廣州市越秀區科技計劃項目（編號：2013-CY-003）