體外心肌細胞缺氧／復氧模型損傷及參元丹干預的影響

楊志海 佟 彤 劉紅旭 尚菊菊 邢文龍 李 享（首都醫科大學附屬北京中醫醫院心血管科，北京，100010）

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體外心肌細胞缺氧／復氧模型損傷及參元丹干預的影響

楊志海 佟 彤 劉紅旭 尚菊菊 邢文龍 李 享
（首都醫科大學附屬北京中醫醫院心血管科，北京，100010）

摘要目的：建立體外培養乳鼠心肌細胞缺氧／復氧模型，觀察益氣逐瘀組方參元丹（SYD）對模型心肌細胞存活率和細胞損傷程度的影響，以進一步探討其改善冠心病圍手術期心肌損傷的作用機制。方法：體外培養大鼠乳鼠原代心肌細胞，建立缺氧復氧細胞模型并予分組處理，CCK法檢測心肌細胞存活率，酶法檢測各組細胞培養上清液中磷酸肌酸激酶（CPK）、乳酸脫氫酶（LDH）的含量。結果：模型組存活率低于正常組（P＜0. 05），而CPK、LDH釋放量高于正常組（P＜0. 05）；SYD含藥血清組、PDTC＋SYD組以及PDTC＋空白血清組細胞存活率均高于模型組和空白血清組（P＜0. 05），細胞酶釋放量均低于模型組和空白血清組（P＜0. 05），此3組間的數據比較，差異不具有統計學意義。結論：參元丹能夠提高心肌細胞缺氧／復氧損傷模型的細胞存活率，降低細胞損傷程度；其機制可能通過抑制核因子NF-κB及其介導的氧化應激和炎性反應降低細胞損傷；提示參元丹可能具有圍手術期心肌損傷的保護作用。

關鍵詞冠心病；圍手術期心肌損傷；體外細胞模型；參元丹；NF-κB通路

The Effect of Shen Yuan Dan on the Vitro Myocardial Model Cells with Hypoxia／reoxygenation Injury

Yang Zhihai，Tong Tong，Liu Hongxu，Shang Juju，Xing Wenlong，Li Ting
（Department of Cardiology，Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine affiliated to Capital Medical University，Beijing 100010，China）

Abstract Objective：Culturing the neonatal rat myocardial cells'hypoxia／reoxygenation modle in vitro and observe the effects of Yiqi Zhuyu Formula（Shenyuandan，SYD）on the survival rate and the degree of myocardium cells injury biomarkers，and thus to further discuss the its relieving mechanism on PMI. Methods：Neonatal rat myocardial cells were cultured in vitro to establish the hypoxia／reoxygenation model. Then use CCK-8 assay to detect the survival rate and enzymatic assay to detect the levels of CPK and LDH on each cell culture supernatant. Results：Compared with the normal group，the survival rate of the model group is lower （P＜0. 05）and the CPK and LDH release quantity is higher（P＜0. 05）. The survival rate of SYD drug-containing serum group，PDTC＋SYD and PDTC＋blank serum group were higher than those of model group and blank group（P＜0. 05）；serum cell enzyme（CPK，LDH）release quantity are lower than those of the model group and blank serum group（P＜0. 05），while there was no statistical difference among the three groups. Conclusion：Shen Yuan Dan can improve the cell survival rate of myocardial cell hypoxia／reoxygenation injury model and relieve cell injury. This may because it can reduce cell damage through inhibiting NF-κB and its mediated oxidative stress and inflammatory response. It indicates that Shen Yuan Dan could protect myocardium cells.

Key Words CHD；PMI；In vitro cell model；SYD；NF-κB pathway

冠狀動脈介入治療（Percutaneous Coronary Intervention，PCI）已經成為冠心病最重要的治療方法并越來越廣泛的應用于臨床。圍手術期心肌損傷（PMI）是PCI常見并發癥。本研究在前期研究的基礎上，通過建立體外心肌缺氧／復氧細胞損傷模型，觀察中醫藥制劑SYD含藥血清干預對心肌細胞存活率及損傷程度的影響，并初步探討SYD通過抑制核因子NF-κB介導的信號通路發揮心肌保護作用的分子機制，以期進一步探討其改善冠心病圍手術期心肌損傷的作用機制。

1　材料

1. 1 實驗動物 SD大鼠40只，SPF級，雄性，體重（200±20）g，購于中國醫學科學院實驗動物研究所。（許可證編號：SCXK（京）2009-0007）；新生Wistar大鼠（1～3 d），雌雄不限，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。（實驗動物許可證號：SCXK（京）2006-0009）

1. 2 藥物與試劑 參元丹（參元益氣活血膠囊，院內制劑，99京衛制字［056］第F-2037號）。將參元丹除去包衣，稱重溶于蒸餾水中，以10倍量蒸餾水煮提3次，每次30 min，合并煮提液，濃縮至含生藥0. 048 g／mL的藥液備用；

Ⅱ型膠原酶（CollagenaseⅡ），Sigma；胰蛋白酶（Trypsin），Ameresco；DMEM／F12混合培養基（Dulbeeeo's Modified Eagle Medium／Nutrient Mixture F-12Ham），Hyclone；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS），Gibco（特級）；PBS平衡鹽溶液，Sigma；5-溴脫氧尿嘧啶（5-Bromo-2'-Deoxyuridind，Brd-u），Sigma；吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC），Sigma；無糖Earle's液，M＆C Gene Technology；青霉素-鏈霉素混合液（10 000 U／mL），中國醫學科學院醫學工程研究所；細胞增殖-毒性檢測試劑盒（CCK-8），DOJINDO；肌酸磷酸激酶（CPK）ELISA試劑盒，Rapidbio（RB）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒，南京建成生物工程研究所；95%N2＋5%CO2混合氣體，由北京中醫醫院氧氣站提供。

1. 3 儀器 CO2／O2三氣培養箱（美國Thermo Scientific，3131）；超凈臺（再鑫，CLASS100）；高壓蒸氣滅菌系統（日本SANYO，MLS-3750）；電熱恒溫鼓風干燥箱（重慶萬達公司，CS101-1FB）；低溫高速離心機（德國Sigma，3-18K）；電子分析天平（德國，AE200）；激光共聚焦顯微鏡（日本OLYMPUS，FV1000）；生物分光光度計（德國Eppendof，AG22331）

2　方法

2. 1 含藥血清的制備 將50只大鼠隨機分為給藥組和空白組，每組25只。給藥組給予參元丹0. 048 g／mL、10 mL／kg，空白組給予等量生理鹽水，連續給藥5 d，2次／d，最后一次給藥后1 h對大鼠進行腹腔麻醉，腹主動脈取血，靜置2 h后，3 000 r／min離心10 min，無菌條件下分離血清，將SYD含藥血清和空白血清2組血清分別合并混勻，56℃，30 min滅活，4 mL分裝，封口膜密封，-80℃保存備用。

2. 2 原代心肌細胞培養 將出生1～3 d的Wistar大鼠固定于泡沫板上，75%乙醇常規消毒乳鼠胸腹部皮膚。超凈臺內沿乳鼠第3、4肋間眼科剪打開胸腔，眼科鑷取出心臟，至于盛有預冷PBS培養皿中。剪掉大血管等非心肌組織，反復清洗4次，將心臟剪成1 mm3大小的組織塊，加入5倍于組織體積的胰酶、膠原酶混合消化液（1∶1比例，胰酶以PBS液配制終濃度為0. 08%，膠原酶以DMEM／F12培養液配制，終濃度為0. 08%），于37℃消化，消化完畢后輕輕吹打組織塊，重復消化步驟，收集除第一次以外的細胞懸液至15 mL離心管中，加入等量的含胎牛血清的DMEM／F12培養液終止消化，4℃、800 r／min離心10 min，棄去上清，輕柔吹打成單細胞懸液。過200目篩網，差速貼壁分離法純化心肌細胞（90 min）。加入Brd-U抑制成纖維細胞生長，以5×105密度種板。細胞于37℃、5%CO2、飽和濕度環境培養，48 h換液后開始正式實驗。

2. 3 細胞造模及分組給藥 正常培養48 h的心肌細胞，用DMEM／F12培養基同步化，24 h后進入造模及分組實驗：先棄去培養液，PBS洗3遍，加入預先以95%N2＋5%CO2混合氣飽和15 min的無糖Ear1e'S液：1）模型組：三氣培養箱低氧模式（1%O2、5%CO2，下同）中缺氧培養2 h后，用氧氣飽和的DMEM／F12換液后正常培養4 h；2）SYD含藥血清組：缺氧培養2 h后，加入10%SYD含藥血清繼續正常培養4 h；3）空白血清組：缺氧培養2 h后，加入10%空白血清繼續正常培養4 h；4）NF-κB抑制劑PDTC＋SYD含藥血清組：缺氧培養2 h后，加入終濃度為10-4mol／L的PDTC和10%SYD含藥血清繼續正常培養4 h；5）NF-κB抑制劑PDTC＋空白血清組：缺氧培養2 h后，加入終濃度為10-4mol／L的PDTC和10%空白血清繼續正常培養4 h；6）正常對照組：不做任何處理，加入培養基正常培養6 h。

2. 4 細胞存活率測定及細胞培養液中LDH、CPK含量測定 各組細胞經造模給藥后，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行加樣操作，用分光光度計測得各組OD值。

酶活性計算公式：

3　結果

3. 1 各組心肌細胞存活率的影響 模型組OD值明顯低于正常組（P＜0. 05），而與空白血清組比較未見明顯差異（P＞0. 05）；SYD含藥血清組、PDTC ＋SYD、PDTC＋空白血清組均高于模型組和空白血清組（P＜0. 05）。SYD含藥血清組與PDTC＋SYD 2組均能明顯提高OD值，后者略高于前者，但組間比較沒有統計學意義（P＞0. 05）；SYD組略高于PDTC＋空白血清組，但差異無統計學意義（P＞0. 05）。見表1。

表1　各組細胞存活率±s，n＝6）

表1　各組細胞存活率±s，n＝6）

注：與正常組對比，＃P＜0. 05；與模型組相比，*P＜0. 05；與空白血清組相比，△P＜0. 05。

組別　　樣本（n）　　存活率（OD值）正常對照組60. 46±0. 03模型組　6　0. 24±0. 05＃SYD含藥血清組　6　0. 37±0. 06*△空白血清組　6　0. 26±0. 04 PDTC＋SYD含藥血清組　6　0. 41±0. 07*△PDTC＋空白血清組　6　0. 34±0. 04*△

3. 2 各組細胞上清液CPK、LDH水平 與正常組對比，模型組在缺氧復氧過程中產生明顯的細胞損傷（P＜0. 05），空白血清組未見明顯的改善損傷作用（P＞0. 05）；而SYD含藥血清組、PDTC＋SYD、PDTC＋空白血清組的藥物干預均能不同程度改善細胞損傷（P＜0. 05），但3組間差異無統計學意義（P＞0. 05）。見表2。

表2　各組細胞培養液中CPK、LDH水平（±s，n＝6）

表2　各組細胞培養液中CPK、LDH水平（±s，n＝6）

注：與正常組對比，＃P＜0. 05；與模型組相比，*P＜0. 05；與空白血清組相比，△P＜0. 05。

組別　　樣本（n）CPK （U／L）LDH （U／L）6　 162. 2±16. 9　 188. 4±18. 8模型組　6　 332. 4±22. 3＃　412. 6±24. 6＃SYD含藥血清組　6　 198. 8±19. 8*△277. 4±28. 3*△空白血清組　6　 275. 3±25. 4　 388. 5±22. 7 PDTC＋SYD含藥血清組　6　 177. 6±27. 6*△231. 6±38. 8*△PDTC＋空白血清組　6　 203. 1±20. 9*△278. 3±26. 6正常對照組*△

4　討論

在PMI發生的機制研究中［1-3］，無論是手術操作過程引起的微小血管閉塞、痙攣造成的心肌缺血缺氧，或是缺氧／復氧、缺血再灌注過程引起的氧化應激、鈣超載、炎性反應，均會造成心肌細胞的損傷、代謝和結構的破壞，并引起細胞最終的壞死和凋亡。心肌細胞損傷后，細胞內的蛋白和各種酶類由于細胞功能結構的改變而釋放到細胞外，其中CPK、LDH以及他們的同工酶對于心肌損傷的判斷具有較高的靈敏度和特異性。

中醫藥在改善動脈粥樣硬化血管內皮功能、減輕過氧化損傷、抑制炎性反應、減輕心肌缺血再灌注損傷等方面的功能已經得到證實。首都醫科大學附屬北京中醫醫院心血管科劉紅旭主任醫師基于冠心病心絞痛“氣虛血瘀”的病理特點而制成的具有“益氣逐瘀”功效的院內制劑——參元丹，臨床上對不穩定心絞痛具有良好療效。我們前期的研究結果表明［4-9］，參元丹具有改善心肌缺血、減輕缺血再灌注損傷及促進內源性心肌保護作用，提示在PMI中可能發揮心肌保護作用。

核因子-κB（NF-κB）是一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強子上一段10bp的核苷酸序列特異結合的核蛋白。通常情況下它們都是以二聚體形式和其抑制蛋白IκB結合在一起，存在于胞漿中，在受到諸如缺血缺氧、機械損傷、病毒感染、放射線照射等應激條件下，NF-κB被激活，進而啟動相關靶基因的轉錄，參與炎性反應、免疫反應、細胞凋亡等病理生理過程。研究表明，機體氧化應激與NF-κB激活密切相關，氧化應激過程中活性氧（ROS）大量增加，通過促進具有κB結合位點的炎性反應因子（如IL-6、IL-8、TNF-α等）的表達參與NF-κB激活過程［10］。因此，氧化應激可能作為始動因素，激活NF-κB介導的炎性反應通路，參與了PCI后PMI發生發展的全過程。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（Pyrrolidine Dithiocarbamate，PDTC）為二硫氨基酸酯，具有抗氧化及金屬螯合作用，可以特異性抑制NF-κB活性，有效抑制氧化應激所致的NF-κB的過度表達，可阻止細胞因子誘導炎性反應遞質基因表達。王云等［11］研究也表明，使用NF-κB激活抑制劑吡咯二硫氨基甲酸酯（PDTC）可使心肌NF-κB活性明顯降低，減輕白細胞粘附和浸潤，缺血再灌注損傷顯著減輕。

綜上所述，抑制PCI造成的過氧化損傷和炎性反應，調節NF-KB通路的活性可能是減輕PCI后PMI損傷的重要途徑。因此，本實驗設計通過SYD 和PDTC干預，檢測缺氧／復氧過程引起細胞損傷后細胞的存活率和CPK、LDH釋放量，來初步探討中醫藥制劑對心肌保護的作用機制。

CCK-8法以其高靈敏度、低細胞毒性、方便快捷的特點廣泛應用于細胞增殖-毒性檢測試驗。CPK 和LDH作為較穩定的細胞酶，其釋放水平的高低可以反映細胞損傷程度的高低。本研究中SYD含藥血清組、PDTC＋SYD組以及PDTC＋空白血清組細胞存活率均高于模型組和空白血清組，細胞酶釋放量均低于模型組和空白血清組，且結果均具有統計學意義，表明參元丹能夠改善損傷后的細胞狀況，降低細胞結構的破壞程度。此3組間的數據比較，差異不具有統計學意義，但SYD的干預效果略高于PDTC＋空白血清，且SYD和PDTC兩者聯合干預效果更好，提示SYD可能具有調控細胞缺氧／復氧過程中氧化應激和炎性反應的作用，而這種作用可能與調節NF-κB通路的活性有關，后期實驗可以進一步研究核因子NF-KB相關調控因子的基因和蛋白表達情況，以更深層次探討SYD在發揮圍手術期心肌保護作用方面的分子機制。

5　結論

參元丹能夠提高心肌細胞缺氧／復氧損傷模型的細胞存活率，降低細胞損傷程度；其機制可能通過抑制核因子NF-κB及其介導的氧化應激炎性反應信號通路降低細胞損傷；提示參元丹可能具有圍手術期心肌損傷的保護作用。

參考文獻

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（2016 -02 -24收稿 責任編輯：洪志強）

中圖分類號：R256. 22

文獻標識碼：A

doi：10. 3969／j. issn. 1673 -7202. 2016. 03. 007

通信作者：劉紅旭，男，現任首都醫科大學附屬北京中醫醫院心血管科主任，主任醫師，教授，博士研究生導師，郵編：100010，Tel：（010）52176633

基金項目：國家自然科學基金面上項目（編號：81273741）；北京市科委十病十藥項目（編號：Z141100002214010）；北京市教委科技發展計劃面上項目（編號：KM201310025027）