高通量活性篩選技術在中藥研究中的應用

王曉明，夏爽，李文芳,2，陳浩浩,2，潘桂湘

(1天津中醫藥大學，天津市現代中藥國家重點實驗室培育基地，天津300193；2天津國際生物醫藥聯合研究院)

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高通量活性篩選技術在中藥研究中的應用

王曉明1，夏爽1，李文芳1,2，陳浩浩1,2，潘桂湘1

(1天津中醫藥大學，天津市現代中藥國家重點實驗室培育基地，天津300193；2天津國際生物醫藥聯合研究院)

高通量篩選(HTS)技術是以藥物和靶點之間的相互作用為檢測指標，高通量地篩選與特定靶點具有親和力樣品的技術。與傳統方法相比，HTS具有快速、高效、靈敏、經濟的特點，近年來在中藥研發領域得到較好的應用，有效推動了中藥現代化的進程。HTS包含初篩、復篩、深入篩選、確證篩選四個過程。其模型類別包括分子水平模型、細胞水平模型和動物水平模型。HTS常用的技術包括報告基因系統、熒光影像技術、熒光標記檢測、離子流檢測和微量化技術。

高通量篩選；中藥研究；篩選過程；篩選模型；篩選技術

高通量篩選(HTS)技術出現于上世紀80年代。與傳統方法相比，HTS具有快速、高效、靈敏、經濟的特點，近年來在中藥研發領域得到較好的應用，對加速中藥現代化進程具有積極的意義。本文從篩選過程、模型類別、篩選技術三方面對HTS進行綜述。

1　HTS過程

藥物的治療作用大多由藥物與機體內生物大分子特定位點(靶點)相結合而產生。HTS技術是以藥物和靶點之間的相互作用為檢測指標，高通量地篩選與特定靶點具有親和力樣品的技術。HTS包含初篩、復篩、深入篩選、確證篩選四個過程[1]。初篩是在細胞或分子水平模型上，初步篩選對特定靶點有作用的樣品。復篩是采用與初篩一樣的模型，將初篩有活性的化合物稀釋成一系列的濃度，明確化合物對該靶點的作用特點、作用強度及量效關系。深入篩選是采用與初篩不同但相關的細胞或分子水平模型，結合組織、器官或整體動物模型，證明活性化合物的藥理作用。深入篩選得到的化合物，可作為先導化合物進行結構改造，以得到活性更高、缺點更少的活性物質。確證篩選是對深入篩選獲得的先導化合物或經結構優化的化合物，進行深入的藥理作用、一般毒理及體內過程等研究。對符合藥物屬性的化合物，可將其確定為候選藥物，啟動藥物開發研究程序，進行臨床前研究。

2　HTS模型類別

2.1分子水平模型分子水平模型有酶、離子通道、受體、基因等類型。其優點是藥物作用靶標明確，可直接獲得與藥物作用機制相關的信息；不足之處是只能對特定靶點的單指標進行檢測，提供的藥物與靶點相互作用的信息有限，難以綜合評價藥物的生物活性。

2.1.1酶篩選模型酶篩選模型是根據酶的作用特點，以酶的反應底物、反應產物作為檢測指標，評價藥物對酶活性的影響。周思多等[2]根據碘化硫代乙酰膽堿在膽堿酯酶的作用下分解生成硫代膽堿，后者進一步與顯色劑DTNB迅速作用生成405 nm有光吸收黃色物質的原理，建立了基于酶標儀的乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選模型，考察了48種中藥的不同溶劑提取物對乙酰膽堿酯酶的抑制活性，發現提取物濃度對乙酰膽堿酯酶抑制活性有一定影響，提取物終濃度為76.92 mg/L時，黃柏80%乙醇提取物、元胡80%乙醇提取物和丹參乙酸乙酯提取物的AChE抑制活性較高。凌笑梅等[3]以凝血酶為靶點，建立了基于毛細管電泳法的凝血酶抑制劑篩選模型，研究黃蜀葵、兩色金雞菊和肉從蓉的提取物與凝血酶之間的作用，從11個中藥單體中快速篩選出6個能與凝血酶相互作用的化合物。

2.1.2離子通道篩選模型離子通道是一類通過調節細胞內離子水平來發揮信息作用的大分子膜蛋白。離子通道篩選模型選用表達特定膜通道的細胞模型，以尋找新型膜通道拮抗劑或激活劑[4]。曹明等[5]采用全細胞膜片鉗技術，探討甘松揮發油抗心律失常的離子通道作用機制，發現甘松揮發油可濃度依賴性地抑制大鼠心肌細胞膜L型鈣通道電流。金伶伶[6]采用含囊性纖維化跨膜轉運調節因子(CFTR)和一種對碘高度敏感的綠色熒光蛋白突變體EYFP-H148Q的表達質粒，共轉染至Fischer大鼠甲狀腺上皮細胞中，建立CFTR氯離子通道熒光成像篩選模型，通過測定碘離子通過氯離子通道內流對細胞內EYFP的熒光淬滅動力學，以此來篩選自建中藥樣品庫中能顯著促進CFTR氯離子通道開放的激活劑，成功從16種中藥中發現了能夠糾正ΔF508-CFTR細胞質膜定位障礙的活性成分，經熒光細胞測定模型和Ussing Chamber電生理測定方法，首次確定了木蘭脂素對CFTR氯離子通道具有激活作用。

2.1.3受體篩選模型受體是位于細胞膜表面或細胞內具有特異識別和結合功能的蛋白組分[7]，受體的異常變化會導致某些疾病的發生。以異常受體作為藥物篩選新靶點，可為治療疾病提供新的線索。萬娟等[8]以對第二信使變化敏感的響應元件和熒光素酶報告基因，構建報告基因質粒，然后將報告基因和受體基因共轉染到HEK293細胞，建立了高通量的人胰高血糖素受體拮抗劑篩選模型，對300多種中藥提取物進行篩選，發現有多個提取物對胰高血糖素受體具有拮抗劑活性。唐建華等[9]將低密度脂蛋白受體/熒光素酶報告基因質粒轉染至HepG2細胞中，建立了靶向LDL受體轉錄活性報告基因篩選模型，對500余種中藥提取物進行篩選，發現決明子、澤瀉、穿龍薯蕷等提取物具有陽性結果。閻雨等[10]將重組質粒pHABHis-IL6R轉染至HEK293T細胞中，建立一種白介素6受體小分子拮抗劑HTS模型，對2 700個中藥粗提物進行篩選，發現13個粗提物抑制率>50%。

2.2細胞水平模型細胞水平模型是在活細胞條件下研究藥物對生命體功能的影響，能夠比較準確地了解藥物的生物學特性，尤其適用于功能蛋白難以分離、生化分析不能實現的復雜靶標或多個靶標的研究，可通過一次試驗獲得多個參數的高內涵信息，還可以得到部分藥物的不良反應信息[11]。李璇等[12]采用與多元醇通路激活和糖尿病微血管病變密切相關的視網膜周細胞、腎小球系膜細胞，建立了一種適用于中藥醛糖還原酶抑制劑高通量細胞篩選模型，采用酶促微量反應熒光法檢測細胞內山梨醇含量，可有效避免中藥粗提物或黃酮類提取物對反應體系的干擾。曹婧等[13]將H3R基因質粒與報告基因質粒共轉染至HEK293細胞內，建立了一種基于報告基因的組胺H3受體(H3R)激活劑的高通量細胞篩選模型，對20種中藥300個組分進行篩選，發現2個對H3R有活性的中藥組分。范益軍等[14]將胰升血糖素樣肽-1(GLP-1)受體質粒和報告基因質粒共轉染到CHO細胞中，建立了一種GLP-1受體激動劑的高通量細胞篩選模型，對200種中藥的醇提物庫進行篩選，發現5種中藥有直接激活GLP-1受體的活性。

2.3動物水平模型動物水平模型適用于機制還不明確、缺少有效篩選靶點的疾病(尤其是功能缺失性遺傳病)，或者影響整體器官而非個別細胞的疾病，或者器官與細胞在生理上的聯系不能在體外構建，但對疾病進展至關重要的情況[15]。Moy等[16]以線蟲為模型動物，采用384孔板自動顯微成像分析，對37 200個化合物及中藥提取物進行篩選，發現未曾報道的28個化合物及中藥提取物能夠提高糞腸球菌感染后線蟲生存率，具有潛在抗菌活性。秦帥[17]利用分子克隆、顯微注射、活體攝像等方法，建立由綠色熒光蛋白標記巨噬細胞和巨噬細胞遷移、聚集的轉基因斑馬魚(Zlyz-EGFP)模型，對296種中藥乙醇提取物的抗炎活性進行篩選，發現2、3、28、35號中藥可以顯著抑制Zlyz-EGFP斑馬魚巨噬細胞向急性損傷部位遷移、聚集。

3　篩選技術

3.1報告基因系統報告基因是指一組編碼易被檢測的蛋白質或酶的基因，將其與目的基因融合后，可通過熒光、比色或發光的方法檢測報告基因的表達來間接報告目的基因的表達調控。目前應用較多的報告基因有β-半乳糖苷酶、熒光素酶、分泌型堿性磷酸酶及熒光蛋白家族等。韋忠紅等[18]構建了pGL3-TNF-α3′UTR熒光素酶報告基因載體，并與pSVRenilla質粒組成雙熒光素酶報告系統，共轉染至RAW264.7單核巨噬細胞，用脂多糖誘導后HTS對TNF-α轉錄后調控有影響的丹參酮類成分，結果發現隱丹參酮可以對TNF-α的轉錄后水平進行抑制調控。

3.2高內涵篩選技術高內涵篩選技術應用高分辨率的熒光數碼影像系統，在細胞水平上實現檢測指標的多元化和功能化。在保持細胞結構和功能完整的前提下，盡可能同時檢測樣品對細胞、形態、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉導等多環節的影響，從單一實驗中獲得大量信息，確定被篩選樣品的生物活性及潛在毒性。其特點是多指標、多靶點同時檢測，涉及的靶點包括細胞膜受體、細胞器及胞內成分等，非常適用于中藥多組分、多靶點的研究。

高內涵的生物學應用包括細胞周期、細胞毒性、細胞凋亡、細胞遷移、受體內化、G蛋白偶聯受體調節劑、活性物質釋放(活性氧、胞內鈣離子、一氧化氮)等。在細胞毒性方面，目前已建立一種能夠直接反映細胞數目、核形態學變化及線粒體聚集等多個指標的高內涵模型[19]。它利用三重熒光標記法，用Hoechst3334(EX350/EM461)標記細胞核呈藍色，用MitoTracker(EX556/EM573)標記細胞質中的線粒體呈紅色，用微管免疫印跡熒光反應二抗標記AlexaFluor488(EX494/EM519)呈綠色，經高內涵成像系統分析(藍色熒光變化與細胞數目、核形態相關；紅色熒光變化與線粒體聚集相關)，對樣品造成細胞毒性的作用機理進行判斷。閆秀川等[20]利用人正常肝細胞株HL-7702，以TNF-α誘導的肝細胞凋亡為篩選模型，建立基于細胞核和線粒體損傷的高內涵篩選方法，對丹參的抗肝損傷與抗肝纖維化的物質基礎進行研究，發現丹酚酸A、丹酚酸B有良好的抗肝細胞凋亡作用。

3.3熒光標記檢測技術熒光猝滅檢測、熒光偏振檢測、熒光共振能量轉移檢測和均相時間分辨熒光共振能量轉移檢測等熒光檢測技術在HTS中有廣泛的應用。其原理是被篩選的藥物與熒光標記靶標相互作用，會導致熒光強度的改變，從而可以推測藥物與靶標的相互作用信息[21]。熒光檢測技術適用范圍從酶抑制劑篩選，拓展到以離子通道、受體、細胞為靶點的高通量藥物篩選[22]。由于僅有少數化合物可以產生熒光，對于那些缺乏熒光活性的篩選系統，常將篩選系統內的分子與熒光活性分子鍵合標記，以此作探針來反映樣品的作用情況[23]。

中藥成分具有復雜性、多效性、雙向調節性等特點，在作用方式上具有多環節、多途徑、多靶點的特點。HTS技術用于研究中藥單體，可根據獲得的結果直接評價化合物的生物活性；用于研究中藥提取物，可根據篩選結果跟蹤提取分離，確定活性組分或活性化合物，減少化合物分離提純的復雜操作；用于研究中藥復方，可根據篩選結果對復方的配伍、比例、活性部位等進行篩選，確定最佳復方組成及組方原理，提高中藥復方的療效。HTS技術可充分發揮中藥多成分同時檢測的優勢，顯著降低篩選成本、樣品需要量、工作強度，提高中藥樣品的利用度。

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國家自然科學基金資助項目(81173523、81303182)；國家重大新藥創制項目(2012ZX09101202)；國家973計劃項目(2012CB723504)。

潘桂湘(E-mail: guixiangp@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.040

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1002-266X(2016)22-0105-03

2015-10-07)