魚腥草揮發油納米結構脂質載體的制備與評價

張壯麗， 趙 寧， 王亞飛， 趙志鴻， 張小俊， 王桂芳（.河南省醫藥科學研究院藥化科，河南鄭州45005；.鄭州大學藥學院，河南鄭州45000）

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魚腥草揮發油納米結構脂質載體的制備與評價

張壯麗1， 趙 寧2 *， 王亞飛2， 趙志鴻1， 張小俊1， 王桂芳1
（1.河南省醫藥科學研究院藥化科，河南鄭州450052；2.鄭州大學藥學院，河南鄭州450001）

摘要：目的 制備并評價魚腥草揮發油納米結構脂質載體。方法 采用熔融乳化-超聲分散法，在單因素考察的基礎上利用正交實驗設計，優化了制劑處方及制備工藝。采用氣相色譜法，建立了納米結構脂質載體中魚腥草揮發油的定量測定方法，并從外觀、形態、粒徑分布、包封率、載藥量及短期穩定性等方面對制劑進行評價。結果 最佳處方為單硬脂酸甘油酯0.12 g，辛酸癸酸三甘油酯0.08 g，泊洛沙姆188 0.533 g，蛋黃卵磷脂0.267 g，魚腥草揮發油0.1 g，重蒸餾水加至20 mL；最佳工藝為初乳攪拌20 min，超聲分散10 min，超聲振幅100%。所制備的納米粒平均粒徑約為（70.76±1.74）nm，Zeta電位為（-25.40±1.08）mV，包封率90.33%，載藥量5.76%。結論 所制備的魚腥草揮發油納米結構脂質載體粒徑小，包封率高，物理穩定性較好。

關鍵詞：魚腥草；揮發油；納米結構脂質載體；熔融乳化-超濾離心；氣相色譜（GC）

Preparation and evaluation of nanostructured lipid carrier loaded With volatileoil from Houttuynia cordatu Thunb.

ZHANG Zhuang-1i1， ZHAO Ning2 *， WANG Ya-fei2， ZHAO Zhi-hong1， ZHANG Xiao-jun1，WANG Gui-fang1
（I.Department of Medicinal Chemistry，Henan Provincial Academy of Medical Sciences，Zhengzhou 45OO52，China；2.College of Pharmaceutical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 45OOOI，China）

KEY W 0RDS：Houttuynia cordatu Thunb.；vo1ati1e oi1；nanostructured 1ipid carrier；me1ting emu1sification and centrifuga1u1trafi1tration；gas chromatography（GC）

魚腥草揮發油是魚腥草Houttuynia cordatu Thunb.的主要活性部位［1］，具有抗病毒、抗菌、抗炎、提高機體免疫力、抗過敏、抗腫瘤等藥理作用［2-8］，目前臨床應用于消炎抗菌。中藥揮發油溶解性差、易揮發、性質不穩定，直接使用時生物利用度低，刺激性大，藥效不穩定。若將納米制劑技術應用于中藥揮發油，不僅能提高藥物的穩定性和生物利用度，加強靶向及緩釋作用，還可減少不良反應，開發出順應性更好的給藥途徑的藥物［9］。

本實驗采用熔融乳化-超聲分散法制備魚腥草揮發油納米結構脂質載體，以納米粒粒徑及Zeta電位為評價指標，在單因素考察的基礎上利用正交實驗設計，優化了制劑處方及制備工藝。采用氣相色譜法，建立了納米結構脂質載體中魚腥草揮發油的定量測定方法，并從外觀、形態、粒徑分布、包封率、載藥量及穩定性等方面對制劑進行評價。

1 材料與儀器

1.1 主要材料 魚腥草揮發油（原藥材購自四川江油，由河南中醫學院藥學院董成明教授鑒定。將魚腥草干燥粉碎后，稱取100 g，裝入2 000 mL圓底燒瓶中，加10倍量蒸餾水，混勻并浸泡10 h后，水蒸氣蒸餾提取，回流10 h，收集淺黃色揮發油，精密稱定質量，4℃下封裝保存備用）。單硬脂酸甘油酯（天津市科密歐化學試劑有限公司）；山崳酸甘油酯（法國嘉法獅公司）；辛酸/癸酸甘油三酯、泊洛沙姆188（德國巴斯夫股份公司）；蛋黃卵磷脂（上海艾偉特醫藥科技有限公司）。甲基正壬酮對照品（中國食品藥品檢定研究院）

1.2 主要儀器 7890A氣相色譜儀、Hp-5MS毛細管色譜柱（美國安捷倫公司）；JEM-2100透射電鏡（日本電子株式會社）；ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀（馬爾文儀器中國有限公司）；VCX130超聲細胞破碎儀（美國Sonics公司）；YIT-3熔點儀（天津大學精密儀器廠）；超濾離心管（100 kDa，密理博中國有限公司）

2 方法

2.1 甲基正壬酮測定方法 目前，魚腥草揮發油的測定主要以含有量高、性質比較穩定的甲基正壬酮為定量指標［10］。

2.1.1 樣品溶液制備 精密量取納米結構脂質載體1 mL，置于10 mL量瓶中，加水定容，移取4 mL，置于25 mL圓底燒瓶中，加正己烷5 mL，密封，室溫水浴超聲萃取20 min，靜置，取正己烷層。再加正己烷5 mL，超聲萃取10 min，收集合并正己烷層，定容至10 mL，0.22 μm濾膜過濾，即得。

2.1.2 色譜條件 采用氣相色譜法，檢測納米結構脂質載體中揮發油含有量。HP-5MS石英毛細管色譜柱；載氣為氦氣；尾吹氣為氮氣；進樣口、氫火焰離子化檢測器溫度280℃；空氣體積流量450 mL/min；H2體積流量40 mL/min；柱體積流量1 mL/min；進樣量1 μL；分流比20∶1；程序升溫（70℃保持5 min，5℃/min升至100℃，2℃/min升至123℃，保持3 min，30℃/min升至280℃，保持10 min）。

2.1.3 系統適用性試驗 取空白制劑和載藥制劑，按照“2.1.1”項下方法處理樣品，并制備甲基正壬酮對照品溶液。3種樣品溶液在“2.1.2”項色譜條件下進樣檢測，記錄色譜圖。

2.1.4 精密度考察 分別制備高、中、低質量濃度甲基正壬酮溶液，連續進樣5次，測定日內精密度，連續5 d；每天進樣1次，測定日間精密度。2.1.5 檢測限及定量限 配制系列質量濃度的甲基正壬酮溶液，在“2.1.2”項色譜條件下進樣，分別計算不同濃度樣品溶液色譜峰的信噪比（S/N）。S/N為10∶1時的樣品質量濃度為定量限，而3∶1時的質量濃度為檢測限。

2.1.6 加樣回收率 精密量取相當于處方量80%、100%、120%的甲基正壬酮溶液，加入到揮發油含有量已知的納米結構脂質載體中，平行3份，按“2.1.1”項下方法制備樣品溶液，在“2.1.2”項色譜條件下進樣檢測，計算回收率。

2.1.7 線性關系考察 配制甲基正壬酮對照品母液（1.640 4 mg/mL），按比例稀釋成系列質量濃度（4.986 8、9.973 63、16.010 3、20.012 9、24.999 70、50.032 2、100.064 4、149.932 6、199.964 8、249.997 0、350.061 4、399.929 5 μg/mL）溶液，在“2.1.2”色譜條件下進樣，記錄峰面積。以對照品溶液質量濃度為橫坐標（X），色譜峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸分析。

2.2 魚腥草揮發油納米結構脂質載體的制備

2.2.1 熔融乳化-超聲分散法 將表面活性劑加適量重蒸餾水超聲溶解，作為水相；固/液脂質水浴熔融后加入處方量的揮發油混勻，作為油相，電磁攪拌下將水浴等溫的水相緩慢加到油相中攪拌，形成初乳，然后超聲分散，冷水浴冷卻固化，0.22 μm微孔濾膜濾過，加水定容至設定處方量，即得魚腥草揮發油-納米結構脂質載體的膠體分散體系。

2.2.2 空白納米結構脂質載體制備工藝影響因素考察 預設定處方為單硬脂酸甘油酯0.32 g，辛酸/癸酸三甘油酯0.08 g，蛋黃卵磷脂0.2 g，泊洛沙姆188 0.2 g，加重蒸餾水至20 mL，進行制備工藝考察。

2.2.2.1 制備溫度 熔點測定儀測定固體脂質及固/液脂質混合物的熔點，用于確定制備溫度。

2.2.2.2 單因素試驗設計 采用“2.2.2.1”項下方法篩選出的制備溫度，選擇攪拌時間、超聲時間、超聲振幅3個因素作為單因素考察對象，按“2.2.1”項下方法制備空白納米結構脂質載體，以粒徑為評價指標，考察上述因素對其的影響。各因素水平見表1。

表1 單因素試驗因素水平Tab.1 Factors and levels of single factor test

2.2.2.3 正交試驗設計 根據“2.2.2.2”項下實驗結果，選擇攪拌時間、超聲時間和振幅3個因素作L9（34）正交試驗設計，按照“2.2.1”項下方法制備空白納米結構脂質載體，以粒徑分布為評價指標，篩選最佳制備工藝。正交試驗因素水平見表2。

表2 正交設計因素和水平Tab.2 Factors and levels of orthogonal design

2.2.2.4 工藝驗證 處方為單硬脂酸甘油酯0.32 g，辛酸/癸酸三甘油酯0.08 g，蛋黃卵磷脂0.2 g，泊洛沙姆188 0.2 g，加重蒸餾水至20 mL。按“2.2.2.3”項下最佳工藝條件平行制備3批空白納米結構脂質載體，檢測其粒徑分布。

2.2.3 魚腥草揮發油納米結構脂質載體處方篩選

2.2.3.1 固體脂質種類篩選 選擇泊洛沙姆188-蛋黃卵磷脂（1∶1）作為復合乳化劑，用量2%；揮發油投藥量1%；辛酸/癸酸三甘油酯作為液體脂質，固-液脂質比4∶1，總脂質用量2%。分別采用單硬脂酸甘油酯、山崳酸甘油酯作為固體脂質，按“2.2.1”項下方法制備魚腥草揮發油-納米結構脂質載體，考察固體脂質種類對其的影響。

2.2.3.2 固-液脂質比例篩選 揮發油投藥量0.5%，單硬脂酸甘油酯-辛酸癸酸三甘油酯作為固-液脂質，其余條件不變，考察固-液脂質比例為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4時對納米結構脂質載體的影響。

2.2.3.3 脂質用量篩選 固液脂質比7∶3，其余條件不變，考察脂質用量為0.5%、1%、2%、3%、4%、5%時納米結構脂質載體的粒徑分布和表面電位。

2.2.3.4 乳化劑配比及用量篩選 總脂質用量1%，其余條件不變，考察乳化劑配比及用量對納米結構脂質載體的影響。

2.2.3.5 投藥量篩選 泊洛沙姆188-蛋黃卵磷脂比例2∶1，復合乳化劑用量4%，其余條件不變，考察投藥量為0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%時納米結構脂質載體性狀的變化情況。

2.2.3.6 正交試驗優化處方 依據單因素試驗結果，選擇乳化劑量、脂質用量、固/液脂質比和投藥量4個因素作L9（34）正交試驗設計，按照“2.2.1”項下方法制備魚腥草揮發油-納米結構脂質載體，檢測其粒徑分布和Zeta電位，并以粒徑分布為評價指標，篩選最佳處方。正交試驗因素水平見表3。

表3 正交設計因素和水平Tab.3 Factors and levels of orthogonal design

2.2.3.7 處方驗證 按照“2.2.3.6”項下最佳處方條件，采用“2.2.1”項下方法平行制備3批魚腥草揮發油-納米結構脂質載體，檢測其粒徑分布和Zeta電位。

2.3 魚腥草揮發油納米結構脂質載體制劑學評價

納米給藥系統能明顯改變藥物在體內的吸收、分布與代謝行為，通常具有緩釋、控釋等作用，而小于100 nm的顆粒可有效避免血液的首過清除效應。這些特性取決于載體自身的制劑學性質，包括粒徑、Zeta電位、包封率、釋放特性等，故有必要對納米結構脂質載體的制劑學性質進行詳細評價。

2.3.1 形態觀察 透射電鏡觀察魚腥草揮發油-納米結構脂質載體的表面形態。將其混懸液適當稀釋后，滴至覆有支持膜的銅網上，紅外燈下烘干水分，觀察納米結構脂質載體納米粒形態并拍照。

2.3.2 粒徑分布及Zeta電位 粒度分析是納米載藥系統的主要表征方面之一，通過一定的檢測手段來精確測量納米顆粒的粒徑，并對粒徑分布進行分析。多分散系數（PdI）是粒徑分布的衡量指標，PdI值越小，粒徑分布越窄，納米粒度越均勻；Pd I值越大，粒徑分布范圍越寬，納米粒間可能因相互碰撞造成聚集、團聚，物理穩定性差。

Zeta電位是指顆粒的剪切面電位，其絕對值越大，表示顆粒所攜帶的正或負電荷越多，顆粒之間的排斥力越大，整個體系相對穩定；反之則穩定性越差。

將魚腥草揮發油-納米結構脂質載體稀釋10倍，采用馬爾文納米粒度及Zeta電位分析儀檢測其粒徑分布及Zeta電位，平行3次，求出平均值。2.3.3 包封率

2.3.3.1 包封藥量測定 準確量取魚腥草揮發油-納米結構脂質載體1 mL，置于超濾管內管中，8 000 r/min離心20 min，收集納米粒，按照“2.2.1”項下方法制備樣品溶液，在“2.1.2”項色譜條件下進樣檢測，記錄甲基正壬酮峰面積。再

代入“2.1.7”項下標準曲線計算樣品質量濃度。

2.3.3.2 總藥量測定 準確量取魚腥草揮發油-納米結構脂質載體1 mL，按照“2.2.1”項下方法制備樣品溶液，在“2.1.2”項色譜條件下進樣檢測，記錄甲基正壬酮峰面積。再代入“2.1.7”項下標準曲線計算樣品質量濃度。

然后，按照如下公式計算制劑的包封率。

包封率＝（系統中包封的藥量/系統中包封與未包封的總藥量）×100%

2.3.4 載藥量 載藥量（DL）是指納米粒中所含藥物的質量百分率，即載藥量＝（包封藥量/納米粒總質量）×100%

2.4 魚腥草揮發油納米結構脂質載體穩定性研究2.4.1 影響因素試驗

2.4.1.1 高溫對納米結構脂質載體的影響 制備一批魚腥草揮發油納米結構脂質載體，密封分裝于潔凈的西林瓶中，60℃下避光放置10 d，于第0、5和10天取樣，觀察外觀變化，并檢測其粒徑分布和包封率。

2.4.1.2 強光照對納米結構脂質載體的影響 制備一批魚腥草揮發油納米結構脂質載體，密封分裝于潔凈的西林瓶中，放置在光照箱中，于25℃，（4 500±500）1x照度下放置10 d，于第0、5和10天取樣，觀察外觀變化，并檢測其粒徑分布和包封率。

2.4.2 短期儲藏穩定性試驗 將魚腥草揮發油納米結構脂質載體密封分裝于潔凈的西林瓶中，避光放置在4℃和室溫3個月，于第1、7、15、30、60和90天取樣，觀察外觀變化，檢測粒徑和包封率。

3 結果與分析

3.1 制劑含量分析方法的建立

3.1.1 系統適用性試驗 由甲基正壬酮對照品溶液、揮發油納米結構脂質載體樣品溶液及空白納米結構脂質載體樣品溶液的GC色譜圖（圖1～3）可知，在設定的色譜條件下，甲基正壬酮出峰時間為19.63 min，而空白樣品在該位置無色譜峰出現，說明制劑輔料對揮發油含有量測定無影響，該方法專屬性良好。

3.1.2 精密度考察 分別取低、中、高3種質量濃度的對照品溶液，氣相色譜檢測記錄峰面積，結果見表4。由表可知，3種質量濃度對照品溶液色譜峰面積的日間及日內ISD值均小于3%，表明儀器的精密度良好。

3.1.3 檢測限及定量限 計算系列質量濃度甲基正壬酮溶液色譜峰的信噪比（S/N）。結果，S/N＝3時對應的樣品質量濃度為1.509 2 μg/mL，即檢測限；S/N＝10所對應的樣品質量濃度為4.986 8 μg/mL，即定量限。

圖1 甲基正壬酮溶液GC色譜圖Fig.1 GC chromatogram of 2-undecanone

圖2 納米結構脂質載體樣品GC色譜圖Fig.2 GC chromatogram of nanostructured lipid carrier sam ple

圖3 空白納米結構脂質載體樣品GC色譜圖Fig.3 GC chromatogram of blank nanostructured lipid carrier sam p le

表4 精密度試驗結果（n＝5）Tab.4 Results of precision tests（n＝5）

3.1.4 加樣回收率（表5） 由表可知，3種質量濃度的加樣回收率均在95%～105%之間，而且ISD值較小，說明該方法準確度良好。

3.1.5 線性關系考察 以甲基正壬酮對照品溶液質量濃度（μg/mL）為橫坐標（X），峰面積（A）為縱坐標（Y），標準曲線方程為Y＝6 962.3X-11 527（r＝0.999 9），表明在4.986 8～399.929 5 μg/mL范圍內線性關系良好。

表5 加樣回收率試驗結果Tab.5 Results of recovery tests

3.2 魚腥草揮發油納米結構脂質載體的制備

3.2.1 空白納米結構脂質載體制備工藝影響因素3.2.1.1 制備溫度 不同種類脂質熔點測定結果見表6。由表可知，固體脂質中加入液態脂質能使熔點降低，黏度減小，更有利于小粒徑納米粒的形成，并選擇以單硬脂酸甘油酯為固體脂質的納米結構脂質載體制備溫度60℃，以山崳酸甘油三酯為固體脂質的納米結構脂質載體制備溫度75℃。

表6 不同種類脂質體的熔點Tab.6 M elting points of different kinds of lipids

3.2.1.2 初乳攪拌時間 納米結構脂質載體粒徑分布隨乳化攪拌時間的變化情況見表7。由表可知，在一定時間范圍內，其粒徑隨攪拌時間的延長而逐漸減小，多分散系數（PDI）也隨之降低，說明粒度分布更均勻。為縮短制備時間，選擇攪拌10 min來考察其他因素對納米結構脂質載體的影響。

表7 攪拌時間對納米結構脂質載體粒徑的影響Tab.7 Effect of stirring time on the particle size of nanostructured lipid carrier

3.2.1.3 超聲分散時間與振幅 納米結構脂質載體粒徑分布隨超聲分散時間的變化情況見表8。由表可知，在一定時間范圍內，超聲分散時間越長，所得納米粒徑越小，而且粒度分布更均勻。

表8 超聲分散時間對納米結構脂質載體粒徑的影響Tab.8 Effect of u ltrasonic tim e on the particle size of nanostructured lipid carrier

3.2.1.4 超聲振幅 納米結構脂質載體粒徑分布隨超聲振幅變化情況見表9。由表可知，超聲分散時的振幅對粒徑影響較大，納米粒粒徑隨其增大而減小，但對粒徑分布的影響較小。

表9 超聲振幅對納米結構脂質載體粒徑的影響Tab.9 Effect of ultrasonic amp litude on the particle size of nanostructured lipid carrier

3.2.1.5 正交試驗篩選最佳工藝 根據單因素試驗結果，選擇攪拌時間、超聲時間和振幅3個因素作L9（34）正交試驗設計，以粒徑為評價指標，進行方差分析及直觀分析，結果見表10和表11。

表10 方差分析Tab.10 Analysis of variance

按檢驗水準α＝0.05，3個因素中僅超聲振幅對納米粒徑具有顯著性影響（P＜0.05）。

直觀分析結果顯示，極差值C＞B＞A，即3個因素對粒徑的影響程度順序為C（超聲振幅）＞B（超聲時間）＞A（攪拌時間）；均值KA1＞KA2＞KA3，KB1＞KB3＞KB2，KC1＞KC2＞KC3，由于納米粒徑越小越好，故較優水平為A3B2C3，但因為KA2與KA3非常接近，從縮短生產周期的角度考慮，決定選擇A2。綜上所述，最佳因素水平為A2B2C3，即初乳攪拌20 min，超聲分散10 min，振幅100%。

表11 直觀分析Tab.11 Intuitive analysis

3.2.1.6 最佳工藝驗證 按照最佳工藝制備的空白納米結構脂質載體粒徑小，粒度均勻，而且Zeta電位絕對值較大，說明納米粒穩定。同時，納米粒徑的ISD為1.18%，表明該工藝重復性好，穩定可靠，具有實際應用價值。結果見表12。

表12 驗證試驗結果Tab.12 Results of verification tests

3.2.2 魚腥草揮發油納米結構脂質載體處方篩選3.2.2.1 固體脂質種類篩選 兩種固體脂質相比，單硬脂酸甘油酯納米結構脂質載體的粒徑更小，粒度分布均勻，而且穩定性更好，其平均粒徑ISD 為2.21%，而山崳酸三甘油酯納米結構脂質載體的平均粒徑ISD為5.64%。因此，選擇單硬脂酸甘油酯作為納米結構脂質載體的固體脂質。篩選結果見表13。

表13 固體脂質種類對納米結構脂質載體粒徑及Zeta電位的影響Tab.13 Effects of solid lipid type on the particle size and Zeta potential of nanostructured lipid carrier

3.2.2.2 固-液脂質比例篩選 納米結構脂質載體的粒徑分布及Zeta電位隨固液脂質比例變化情況見表14。由表可知，隨著液體脂質比例的增大，納米粒粒徑逐漸減小，PDI值也總體降低。

表14 固/液脂質比例對納米結構脂質載體粒徑及Zeta電位的影響Tab.14 Effects of lipid solid/liquid ratio on the particle size and Zeta potential of nanostructured lipid carrier

3.2.2.3 脂質用量篩選 隨著體系中脂質總量的增加，納米結構脂質載體粒徑呈明顯增大的趨勢，PDI與Zeta電位的變化均表明體系的物理穩定性降低。由于脂質量0.5%與1%的粒徑差別不大，考慮到單位體積制劑中，脂質量越大，所能承載的揮發油越多。因此，結合粒徑分布及體系穩定性，選擇適宜的脂質用量為1%。篩選結果見表15。

表15 脂質用量對納米結構脂質載體粒徑及Zeta電位的影響Tab.15 Effects of lipid dosage on the particle size and Zeta potential of nanostructured lipid carrier

3.2.2.4 乳化劑配比及用量篩選 單獨使用泊洛沙姆188制得的納米結構脂質載體穩定性很差；單獨使用蛋黃卵磷脂制得的納米結構脂質載體粒徑很大，而且粒度分布不均，如兩者結合使用，則能顯著彌補對方的缺陷。復合表面活性劑用量相等時，泊洛沙姆188比例越大，納米結構脂質載體粒徑越小；復合表面活性劑配比固定時，用量越大，則粒徑越小。綜合考慮粒徑及體系穩定性，選擇復合乳化劑為泊洛沙姆188-蛋黃卵磷脂（2∶1），用量4%。篩選結果見表16。

3.2.2.5 投藥量篩選 隨著揮發油投藥量的增加，納米結構脂質載體的粒徑呈先減小后增大的趨勢，Zeta電位絕對值也隨之先增大后減小。魚腥草揮發油納米結構脂質載體的體系呈淡黃色，而且隨投藥量增加，顏色逐漸加深。另外，3～7號樣品瓶內壁附著一圈細小的油滴，可能是未被包封的過量揮發油。從節省成本的角度出發，選擇投藥量0.5%。篩選結果見表17。

表16 乳化劑的成分及用量對納米結構脂質載體粒徑及Zeta電位的影響Tab.16 Effects of constituent and dosage of emulsifier on the particle size and Zeta potential of nanostructured lipid carrier

表17 揮發油量對納米結構脂質載體粒徑及Zeta電位的影響Tab.17 Effects of volatile oil dosage on the particle size and Zeta potential of nanostructured lipid carrier

3.2.2.6 正交試驗優化處方 根據單因素試驗結果，選擇乳化劑量、脂質用量、固-液脂質比和投藥量4個因素作L9（34）正交試驗設計。以粒徑為評價指標，正交試驗方差分析顯示，被考察的4個因素對納米粒粒徑的影響均不明顯。直觀分析見表18。

直觀分析結果顯示，極差值B＞D＞A＞C，即4個因素對粒徑的影響程度順序為B（脂質量）＞D（投藥量）＞A（乳化劑量）＞C（固/液脂質比）；均值KA1＞KA2＞KA3，KB3＞KB2＞KB1，KC1＞KC2＞KC3，KD1＞KD2＞KD3，由于納米粒徑越小越好，故最佳因素水平為A3B1C3D3，即復合乳化劑泊洛沙姆188-蛋黃卵磷脂（2∶1）用量4%，混合脂質單硬脂酸甘油酯-辛酸癸酸三甘油酯（6∶4）用量1%，揮發油投藥量0.5%。綜上所述，最佳處方為單硬脂酸甘油酯0.12 g，辛酸癸酸三甘油酯0.08 g，泊洛沙姆1 880.533 g，蛋黃卵磷脂0.267 g，魚腥草揮發油0.1 g，重蒸餾水加至20 mL。

表18 直觀分析Tab.18 Intuitive analysis

3.2.2.7 最佳處方驗證 按照正交試驗所得的最佳工藝及處方，按“2.2.1”項下方法平行制備3批納米結構脂質載體，檢測其粒徑分布和Zeta電位，結果見表19。由表可知，按照最佳工藝及處方制備的魚腥草揮發油-納米結構脂質載體粒徑小，而且粒度分布均勻，Zeta電位絕對值較大，說明納米粒穩定。同時，納米粒徑的ISD為2.46%，表明其重復性好，穩定可靠，具有實際應用價值。

表19 驗證試驗結果Tab.19 Results of verification tests

3.3 魚腥草揮發油納米結構脂質載體制劑學評價

3.3.1 形態觀察 透射電鏡下觀察魚腥草揮發油-納米結構脂質載體，見圖4。由圖可知，納米粒呈圓球狀，輪廓規整，粒度分布比較均勻，無團聚現象。

3.3.2 粒徑分布及Zate電位 將魚腥草揮發油-納米結構脂質載體稀釋10倍，馬爾文納米粒度及Zeta電位分析儀檢測其粒徑分布及Zeta電位，平行3次，計算平均值。結果見圖5～6。

圖4 納米結構脂質載體透射電鏡圖Fig.4 Transm ission electron m icrographs of nanostructured lipid carrier

圖5 納米結構脂質載體粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of nanostructured lipid carrier

圖6 納米結構脂質載體Zeta電位分布Fig.6 Zeta potential distribution of nanostructured lipid carrier

魚腥草揮發油-納米結構脂質載體的粒度呈單峰分布，平均粒徑為（70.76±1.74）nm，粒徑介于10～100 nm之間的納米粒約占總數的96.4%。

由圖可知，魚腥草揮發油納米結構脂質載體的Zeta電位為（-25.40±1.08）mV，體系較穩定。3.3.3 包封率和載藥量 平行制備3批魚腥草揮發油-納米結構脂質載體，按照“2.3.4”和“2.3.5”項下方法檢測其包封率和載藥量，結果見表20。由表可知，納米結構脂質載體的載藥量為5.76%，包封率為90.33%，符合藥典標準（＞80%）。

表20 納米結構脂質載體包封率和載藥量Tab.20 Entrapment efficiencies and drug loadings of nanostructured lipid carrier

3.4 魚腥草揮發油納米結構脂質載體穩定性研究

3.4.1 影響因素試驗

3.4.1.1 高溫對納米結構脂質載體的影響 在60℃下，納米結構脂質載體平均粒徑未發生明顯變化，到第5天時出現少量粒度在10～30 nm之間的粒子，到第10天時降至10～20 nm之間，而且包封率略有降低，可能是由于高溫而導致一小部分不穩定的納米粒破碎。新制備的納米結構脂質載體體系呈淡黃色，澄清透明，隨著時間延長，顏色逐漸加深，透明度下降，但無沉淀析出。具體見表21。

表21 高溫對納米結構脂質載體的影響Tab.21 Effect of high temperature on nanostructured lipid carrier

3.4.1.2 強光照對納米結構脂質載體的影響 強光照對納米結構脂質載體的粒徑和包封率均無明顯影響，但觀察到其體系澄清度有所下降，顏色變為淡乳白色。具體見表22。

表22 強光照對納米結構脂質載體的影響Tab.22 Effect of strong light on nanostructured lipid carrier

3.4.2 短期穩定性考察

3.4.2.1 外觀變化 在90 d的考察期內，室溫下放置的納米結構脂質載體外觀基本未發生變化，到第90天時體系仍澄清透明。但4℃下其外觀變化明顯，到15 d時體系較第1天明顯渾濁，第30天時水分散液已完全不透明，第90天時體系已變為白色乳狀液。

3.4.2.2 粒徑和包封率變化 納米結構脂質載體在室溫下放置90 d后，平均粒徑無明顯變化，但包封率顯著下降，第30天時已低于藥典要求（≥80%），第90天時降至64.44%；在4℃下隨時間的延長，其粒徑明顯增大，粒度分布范圍變寬，系統穩定性降低，包封率也顯著減少。在相同時間下，放置在室溫的納米結構脂質載體粒徑明顯小于放置在4℃者。因此，納米結構脂質載體應選擇在室溫條件下保存。具體見表23。

表23 納米結構脂質載體在室溫及4℃下的穩定性Tab.23 Stabilities of nanostructured lipid carrier at room temperature and 4℃

4 討論

包封率測定過程中分離納米粒與游離藥物的方法有很多，如超速離心法、葡聚糖凝膠柱色譜法、透析法、超濾離心法等。前期實驗發現，魚腥草揮發油納米結構脂質載體經高速離心后，納米粒上浮，放置一段時間后重新擴散，不利于其收集，而葡聚糖凝膠色譜柱也無法將所制備的納米粒與游離藥物很好地分離。若選擇適當型號的超濾管，通過超濾離心法則可將分散體系中的水分濾除，從而得到濃集的納米粒。因此，本實驗最終采用超濾法測定納米結構脂質載體包封率，考慮到制劑粒徑分布，選擇截留分子質量為100 kDa的超濾管。

本實驗采用熔融乳化-超聲分散法，制備了魚腥草揮發油納米結構脂質載體，平均粒徑約為（70.76±1.74）nm，Zeta電位為（-25.40±1.08）mV，包封率90.33%，載藥量5.76%。穩定性試驗結果表明，高溫會導致其外觀顏色的改變，故該制劑應放置在室溫條件下密閉保存。

納米結構脂質載體以生物相容性好、可降解的固-液混合脂質為載體材料，尤其適用于包載揮發油類藥物，為其提供穩定的包封環境，并能有效改善難溶性藥物的吸收和分布行為［11］，提高藥物的生物利用度。文獻［12-14］報道，粒徑在50 nm左右的納米粒可直接通過消化道上皮細胞，吸收進入體循環或淋巴循環系統，從而有效降低口服給藥的肝臟首過效應。因此，基于納米結構脂質載體的這些特點，有希望開發出新型魚腥草揮發油口服制劑。

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［質 量］

*通信作者：趙 寧（1990—），女，碩士生，研究方向為新劑型與新型給藥系統。Te1：18703675693，E-mai1：zhaoningwyyx@ 163.com

作者簡介：張壯麗（1978—），女，博士，助理研究員，研究方向為中藥新藥。Te1：（0371）66658204，E-mai1：zz17814@163.com

基金項目：河南省省屬科研單位社會公益項目預研專項（2013，2014）；河南省重點科技攻關計劃項目（142102310433）

收稿日期：2015-05-18

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.015

中圖分類號：I944

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）03-0546-10