UPLC法測定梔子中的4種成分

2016-04-06 01:24:09石燕紅陳紹成上海中醫藥大學中藥學院上海00重慶市三峽天然藥物研究所重慶404000重慶第二師范學院生物與化學工程系重慶400067

中成藥 2016年3期

錢珺，石燕紅，陳紹成，王瑞 *（.上海中醫藥大學中藥學院，上海00；.重慶市三峽天然藥物研究所，重慶404000；.重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶400067）

UPLC法測定梔子中的4種成分

錢珺1，石燕紅2，陳紹成3，王瑞1 *
（1.上海中醫藥大學中藥學院，上海201203；2.重慶市三峽天然藥物研究所，重慶404000；3.重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶400067）

摘要：目的建立超高效液相色譜（UPLC）法同時測定梔子中京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2的含有量。方法分析采用Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫；檢測波長238 nm和440 nm；體積流量0.3 mL/min；柱溫30℃。結果京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2分別在0.016～0.510 mg/mL（r＝0.999 9）、0.032～1.020 mg/mL（r＝0.999 9）、0.016～0.515 mg/mL（r＝1.000 0）和0.002～0.063 mg/mL（r＝0.999 9）范圍內線性關系良好，平均回收率分別為98.5%、99.0%、100.1%、100.9%，ISD分別為1.2%、1.4%、1.6%、1.7%。結論該方法簡便快速，重復性好，可為梔子質量評價提供參考。

關鍵詞：梔子；京尼平龍膽二糖苷；梔子苷；西紅花苷-1；西紅花苷-2；UPLC

梔子為茜草科植物梔子Gardenia Jasminoides E11is的干燥成熟果實，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒以及外用消腫止痛的功效［1］，而炒梔子、焦梔子為梔子的加工炮制品，苦寒之性較弱，更適于脾胃虛弱者［2］。梔子所含化學成分有環烯醚萜、二萜（西紅花苷）、有機酸、黃酮、香豆素、揮發油、皂苷、木脂素、多糖等，其中具有較強藥理活性者主要為環烯醚萜類及西紅花苷類［3-5］。目前，已有文獻報道用高效液相色譜（HPLC）法，以這兩類成分為指標，對梔子進行質量評價，但分析時間較長［6-10］。

本實驗采用超高效液相色譜（UPLC）技術，建立雙波長法同時測定梔子及其炮制品中2個環烯醚萜類成分（京尼平龍膽二糖苷、梔子苷）和2個西紅花苷類成分（西紅花苷-1和西紅花苷-2）的方法，其簡便可靠，分析時間短，能顯著提高分析效率，可為梔子的質量評價提供參考。

1 儀器與試藥

Waters Acquity超高效液相色譜儀，包括四元泵、柱溫箱、自動進樣器、PDA檢測器和Empower工作站（美國Waters公司）；AE200電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250DB數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

乙腈、磷酸為色譜純（德國Merck公司）；水為超純水（美國Mi11ipore公司產品所制）；其他試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。梔子苷（批號110749-201316）、西紅花苷-1（批號111588-201303）、西紅花苷-2對照品（批號111589-201304）和梔子對照藥材（批號120986-201307）均購自中國食品藥品檢定研究院；京尼平龍膽二糖苷對照品（批號ZM0507BA14，純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司。30批生梔子、2批炒梔子和2批焦梔子均為市售品和產地收集，經重慶第二師范學院陳曉麟教授鑒定為茜草科植物梔子Gardenia Jasminoides E11is的干燥成熟果實，見表1。

表1 不同批次梔子樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～3 min，8%～20%A；3～8 min，20%～35%A）；檢測波長238 nm（0～5 min）、440 nm（5～8 min）；體積流量0.3 mL/min；柱溫30℃；進樣量2 μL。色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液制備精密稱取京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2對照品適量，加甲醇制成每1 mL含京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1、西紅花苷-2 80、250、40和10 μg的溶液，即得。

圖1 混合對照品和梔子的UPLC色譜圖

2.3 供試品溶液制備精密稱取樣品粉末0.2 g（過4號篩），置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲提取（250 W、40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，70%甲醇補足重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 線性關系考察精密稱取京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2對照品適量，置于20 mL量瓶中，加甲醇制成質量濃度分別為0.510、1.020、0.515、0.630 mg/mL的對照品儲備溶液。再精密吸取不同儲備液，稀釋成系列質量濃度的溶液，在“2.1”項色譜條件下測定，進樣2 μL，以對照品質量濃度（mg/m L）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，回歸方程和線性范圍見表2。由表可知，各化合物在相應質量濃度范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗精密稱取樣品粉末（批號ZZ-15052830）1份（0.2 g），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下連續進樣6次，測得京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2峰面積的ISD分別為0.2%、0.2%、0.2%和0.9%，表明儀器精密度良好。

表2 回歸方程及線性范圍

2.6 重復性試驗精密稱取樣品粉末（批號ZZ-15052830）6份，每份0.2 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，測得京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2平均含有量分別為1.54%、5.18%、0.86%、0.08%，ISD分別為1.1%、0.9%、1.3%、1.6%，表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗精密稱取樣品粉末（批號ZZ-15052830）1份（0.2 g），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24、48、72 h進樣，測得京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2峰面積的ISD分別為0.6%、0.6%、0.8%和1.1%，表明供試品溶液在72 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗精密稱取含有量已知的樣品粉末（ZZ-15052830）9份，每份0.1 g，分別按樣品含有量的50%、100%和150% 3個水平加入京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定，計算加樣回收率，結果見表3。

2.9 樣品測定精密稱取樣品粉末0.2 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定，計算京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2的含有量，結果見表4。

3 討論

本實驗應用PDA檢測器，分別對4個指標成分（京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2）對照品溶液進行全波長掃描，發現京尼平龍膽二糖苷和梔子苷的最大吸收波長為238 nm，而西紅花苷-1和西紅花苷-2為440 nm。此外，前2個成分的出峰時間為2～5 min，而后2個成分為5～8 min，故添加波長切換時間，使檢測波長在5 min后自動切換，建立的可變波長UPLC法可以同時測定梔子及其加工炮制品中4個指標成分的含有量。目前文獻報道，采用HPLC法對梔子中環烯醚萜類和西紅花苷類成分進行含有量測定，分析時間在45 min以上，而本實驗中UPLC法的一次分析時間僅需8 min，大幅縮短分析時間，提高了分析效率。

梔子為常用大宗藥材，江西、四川、重慶和湖南為全國四大梔子產地。本實驗所用樣品來自江西、四川、重慶、湖南、湖北、福建、河北、河南、山東和浙江10個地區，測定結果表明，京尼平龍膽二糖苷含有量為0.33%～1.72%，梔子苷為1.59%～5.90%，西紅花苷-1為0.19%～1.26%，西紅花苷-2為0.04%～0.17%。

現行《中國藥典》2015版以梔子苷為指標性成分，規定梔子中其含有量不得低于1.8%，炒梔子中不得低于1.5%，焦梔子中不得低于1.0%。本實驗收集的樣品中除1批生梔子（批號ZZ-15090105）不合格外，其他樣品中梔子苷的含有量均明顯高于藥典規定標準。

同時，梔子還是重要的食用色素和天然染料原料，被廣泛應用于食品、化工等行業。藥典規定，梔子在9～11月果實成熟，呈紅黃色時采收，“表面紅黃色或棕紅色”為梔子中西紅花苷類成分的外觀性狀指示，說明其也是梔子品質優良的重要指標之一［11］。含有量測定結果表明，西紅花苷-1為生梔子中主要的西紅花苷類成分，含有量越高，梔子表面顏色越紅。其含有量低的樣品外觀顏色為灰棕色或棕黃色，而含有量高的樣品外觀顏色為紅黃色，甚至棕紅色。