基于乳酸菌試管計數法的改進研究

方 正 齊美園 趙鵬昊 張 青 朱云鵬（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

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基于乳酸菌試管計數法的改進研究

方 正 齊美園 趙鵬昊 張 青 朱云鵬
（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

摘 要：研究表明試管計數法利用高層瓊脂的良好厭氧性能夠很好地培養和計數乳酸菌，而實驗發現試管法在菌落計數的過程中，仍有部分缺點和不足。本研究對原試管法的裝置做了新的改進，將改進后的試管法與原試管法對比，證實了改進后的試管法能夠更快速、準確地對乳酸菌進行計數。

關鍵詞：乳酸菌；計數；試管法；改進

目前，乳酸菌已被廣泛應用于食品工業中，研究表明大部分乳酸菌為微好氧菌、兼性厭氧菌或專性厭氧菌，馬向前等率先提出利用試管法對乳酸菌等不產氣厭氧或兼性厭氧菌的簡便快速活菌計數，趙強忠等又在前者的實驗基礎上進行了方法上改進，但由于很多菌落生長在試管中間且分布無序以及試管構造的特點，觀察時易產生重影，導致不易計數。

本研究為了使試管法能夠更快速、準確計數，對原試管法的裝置進行了改進。裝置描述：將大試管（外管）加上硬質橡膠塞，橡膠塞上連有灰黑色的同材質實心柱體（內芯），內芯與外管間形成薄層區域。使用方法：在無菌的環境中，將已經滅菌的橡膠塞拔下，取融化的約10mL瓊脂培養基注入大試管中，接種后，蓋上橡膠塞，此時培養基被內芯擠壓到外管的周圍，形成一個薄的培養基層，用于乳酸菌的培養和計數。本試驗通過將改進后的試管法作為試驗方法，趙強忠等所用的原試管法作為對照，研究改進后的試管法的實際使用效果。

1　材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種

鼠李糖乳桿菌GG株（下簡稱LGG）、保加利亞乳桿菌（下簡稱LB）。（由東北農業大學乳品教育部重點實驗室提供）

1.1.2培養基：MRS培養基，按GB 4789.35-2010配制。

1.1.3試劑：草酸銨結晶紫，碘液，番紅，酒精等。

1.1.4儀器和設備：高壓蒸汽滅菌鍋；恒溫培養箱；電熱恒溫水浴鍋；振蕩器；移液器；顯微鏡；錐形瓶；酒精燈等。

1.2試驗方法

1.2.1乳酸菌的活化和鏡檢

將LGG和LB按3%接種量分別接種于MRS液體培養基中，再分別于37℃和42℃恒溫箱培養16h和24h，重復活化培養3代。革蘭氏染色后鏡檢無雜菌，備用。

1.2.2稀釋液的配制

準確稱量0.90g無水NaCl，加入100g水，攪拌溶解均勻，取9mL分裝試管。121℃滅菌15min。

1.2.3乳酸菌的計數

（1）菌液稀釋

將活化后的菌液在振蕩器上震蕩均勻，用移液器移取1mL，加入含有9mL試管的稀釋液中，制成1∶10的稀釋液，并在振蕩器上震蕩均勻，依此類推進行10倍稀釋，將菌夜稀釋到10-7。

（2）接種

改進后的試管法（方法一）：按照前述使用方法，將稀釋到10-6、10-7的菌液分別取0.1mL接種，注意管中不能有氣泡產生，做三個平行樣。將LGG和LB分別在37℃和42℃恒溫箱中培養48h。

原試管法（方法二）：將稀釋到10-6、10-7的菌液分別取0.1mL接種到滅菌的試管培養基中，震蕩均勻，不能有氣泡產生，做三個平行樣。將LGG和LB分別在37℃和42℃恒溫箱中培養48h。

（3）菌落的計數

將兩種方法所得到的試管菌落分別進行計數，記錄菌落數量與計數時間。

2　結果和分析

2.1兩種方法的結果比較

2.1.1方法一和方法二的菌落數

表1為方法一和方法二的菌落數。

2.1.2方法一和方法二的計數時間

表2為方法一和方法二的菌落計數時間。

2.2數據處理與分析

參考GB4789.35-2010中乳酸菌的檢驗與計數方法，若取有兩個連續稀釋度的菌落數在適宜計數范圍內時，按公式計算：

N=∑C/（n1+0.1n2）d

式中：

N——樣品中菌落數；∑C——試管菌落數之和；n1——低稀釋倍數的試管個數；n2——高稀釋倍數的試管個數；d——稀釋因子（低稀釋倍數）。

由表1可知，方法一的同一批次中，三個平行樣無顯著性差異，檢出數據較為穩定，且兩個稀釋度的的比值都接近理論值10，而方法二中有三組偏離10較顯著。根據公式計算，方法一對LGG 和LB的計數結果分別是2.16×109cfu/mL 和1.40×109cfu/mL，方法二對LGG和LB的計數結果分別是2.09×109cfu/mL和1.27×109cfu/mL，可知方法二所得菌落數小于方法一，說明了改進后的試管法對菌數計數的檢出率和準確性都優于原試管法。

由表2可知，在菌落數較少（試驗中小于30）時，方法一和方法二的計數時間相差不大，但當菌落個數較多（試驗中大于100）時，對于菌落數量相差不大進行數時方法二計數時間長，計數較為困難，此時改進后的試管法具有明顯的優越性，體現在計數時間短，重復率更好。

表1　

表2　

結語

本研究中提出的基于原乳酸菌試管計數法的改進，有效地解決了原試管法中因菌落數多、中間部分菌落計數困難的缺點，具有原試管法的檢出率高和重復性高等優點，且具有不易重復計數，計數更快等優點，是一種更加高效、簡便的乳酸菌計數方法。本法亦可應用于其他兼性厭氧菌、耐氧性厭氧菌、微好氧菌等的培養和計數。

參考文獻

[1]趙強忠，趙謀明，蔣文真.一種分離和檢測酸乳中乳酸菌的有效方法[J].食品與工發酵，2007，33（03）：96-99.

[2]孟祥晨，杜鵬，李艾黎.乳酸菌與酸奶發酵劑[M].北京：科學出版社，2007：12-15.

中圖分類號：Q935

文獻標識碼：A