Eμ-VH啟動子調控c-Myc表達慢病毒載體的構建及其體外功能

陳琳，陳燕，肖東

（南方醫科大學，廣州510515）

Eμ-VH啟動子調控c-Myc表達慢病毒載體的構建及其體外功能

陳琳，陳燕，肖東

（南方醫科大學，廣州510515）

目的 構建人B淋巴細胞特異性啟動子Eμ-VH調控癌基因c-Myc表達的慢病毒載體（pEMIR），并探討其體外功能。方法 以pLV-c-Myc-IRES-增強綠色熒光蛋白（EGFP）為模板，經PCR擴增、酶切后得到pEVCHR；以pEVCHR為模板，PCR擴增、酶切后得到慢病毒載體pEMIR，并行測序和酶切鑒定。將pEMIR分別瞬時轉染入人源胚胎腎細胞293T、人彌漫大B細胞淋巴瘤細胞株（OCL-Ly3、OCL-Ly10），倒置熒光顯微鏡檢測各細胞EGFP和單體紅色熒光蛋白（mRFP）的表達，用qRT-PCR法檢測細胞內c-Myc mRNA表達，用Western blotting法檢測293T細胞c-Myc蛋白表達。結果 Eμ-VH-c-Myc-H2BmRFP基因片段電泳結果與預測值4 129 bp相符，Vector DNA電泳可見一條帶與預測值8 561 bp相符；pEMIR酶切并電泳的結果與理論預測值相符；對pEMIR質粒進行測序，結果與預期相符，證明pEMIR構建成功。三種細胞經pEMIR轉染后，倒置熒光顯微鏡下可見綠色和紅色熒光，同時轉基因c-Myc表達正常。結論 成功構建Eμ-VH啟動子調控c-Myc表達的慢病毒載體，體外實驗證明該載體能夠在人正常細胞和腫瘤細胞中均可發揮功能。

Eμ-VH啟動子；c-Myc癌基因；慢病毒載體；彌漫大B細胞淋巴瘤

目前，用于腫瘤研究的動物模型絕大多數是基于遺傳工程的小鼠［1］，極度缺乏人類腫瘤大動物模型。小型豬在常用大型實驗動物中具有諸多優勢［2］。在小鼠轉基因過表達c-Myc，可誘發淋巴瘤［3～5］，且耗時較短。為此我們擬基于小型豬創制人類淋巴瘤模型。目前，慢病毒載體法已成功用于制備轉基因豬［6］。2015年3～12月，本研究構建人B淋巴細胞特異性啟動子Eμ-VH調控c-Myc基因表達的慢病毒載體（pEMIR），并對載體的體外功能進行初步驗證，為制備轉基因豬奠定堅實基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑 攜帶人B淋巴細胞特異性啟動子Eμ-VH的載體pEμ-VH-miR155由美國俄亥俄州立大學Carlo教授惠贈，載體pLV-c-Myc-IRES-增強綠色熒光蛋白（EGFP）（pEMIG）由中國上海生命科學研究院肖磊研究員惠贈，pHIV-H2BmRFP由美國加州大學的Zena教授惠贈，慢病毒載體pCD550A-1購自System Biosciences（SBI）公司。高保真Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性內切酶、In-Fusion克隆試劑盒均購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒購自QIAGEN公司；脂質體轉染劑Lipofectamine2000、高糖DMEM、Opti-MEM I Medium和DMSO等購自Invitrogen公司；培養瓶及培養板等購自Corning公司；其余試劑為國產或進口化學純或分析純。人源胚胎腎細胞293T來源和培養方法見文獻［7］，人彌漫大B細胞淋巴瘤細胞株（OCL-Ly3、OCL-Ly10）由南方醫科大學趙彤教授惠贈。以上細胞所用培養基為含10%胎牛血清的DMEM。

1.2pEMIR的構建 pEμ-VH-miR155進行測序。以質粒pLV-c-Myc-IRES-EGFP為模板，PCR擴增目的基因c-Myc，In-Fusion克隆至利用EcoR V／Sal I酶切的pEμ-VH-miR155中，構建載體pEVC；以pEVC為模板，PCR擴增目的基因Eμ-VH-c-Myc，In-Fusion克隆至利用Hpa I酶切的pHIV-H2BmRFP中，構建載體pEVMHR；以pEVMHR為模板，PCR擴增目的基因Eμ-VH-c-Myc-H2BmRFP，In-Fusion克隆至利用Nhe I／CIa I雙酶切的pCD550A-1中，最終獲得慢病毒表達載體pEMIR。次日挑選單菌落，提取質粒并行測序和酶切鑒定。

1.3pEMIR體外功能檢測 采用LipofectamineTM2000將pEMIR、pCD550A-1（陰性對照）在六孔板內分別瞬時轉染入293T、OCL-LY3和OCL-LY10細胞；同時將pEMIG（陽性對照）瞬時轉染入293T細胞；以上轉染均至少設兩個復孔。轉染24～48 h在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞熒光情況，如果pEMIR瞬時轉染，293T、OCL-LY3和OCL-LY10細胞在倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光，則證明轉染成功。然后分別提取以上細胞總RNA，按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書，逆轉錄成cDNA后，qRT-PCR法檢測細胞內c-Myc mRNA表達，采用2-ΔΔCt公式計算基因相對表達量。轉染72 h提取293T細胞的總蛋白，用Western blotting法檢測293T細胞c-Myc蛋白表達。用Image lab軟件分別對蛋白條帶進行灰度分析，用公式計算實驗組相對于對照組的表達倍數作為實驗組的相對表達量。以上實驗重復3次，取平均值。

1.4統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。計量資料用±s表示，比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1pEMIR構建結果 Eμ-VH-c-Myc-H2BmRFP基因片段電泳結果與預測值4 129 bp相符，Vector DNA電泳可見一條帶與預測值8 561 bp相符；pEMIR酶切并電泳的結果與理論預測值相符；pEMIR質粒測序結果與預期相符。證明pEMIR構建成功。

2.2pEMIR體外功能檢測結果 pEMIR瞬時轉染293T、OCL-LY3和OCL-LY10細胞，在倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光，證明轉染成功。瞬時轉染48 h后倒置熒光顯微鏡下也可見紅色熒光（目的基因表達）。轉染pEMIR后，293T、OCL-LY3和OCL-LY10細胞c-Myc mRNA相對表達量（18.86±0.42、5 928.90±125.13、238.92±6.71）均高于轉染pCD550A-1（均為1.00±0.00），P均＜0.05。轉染pEMIG后，293T細胞c-Myc mRNA相對表達量為368.72±8.66。轉染pEMIR、pEMIG后293T細胞內c-Myc mRNA相對表達量高于轉染pCD550A-1（P均＜0.05）。轉染pCD550A-1、pEMIR、pEMIG后72 h，293T細胞c-Myc蛋白相對表達量分別為0.07 ±0.01、0.15±0.01、3.05±0.05，轉染pEMIR、pEMIG后293T細胞內蛋白相對表達量高于轉染pCD550A-1（P均＜0.05）。

3　討論

慢病毒屬于逆轉錄病毒的一種，不僅可以高效感染處于分裂期的細胞，而且可以感染非分裂期的細胞；借助慢病毒可將其攜帶的外源目的基因高效整合進宿主細胞基因組中，外源目的基因可在細胞內長期穩定地表達。目前，慢病毒載體法已成功用于制備轉基因豬。利用慢病毒載體法制作轉基因豬，操作比較簡單，而且能夠確保研究者在很短的時間內獲得目標轉基因動物，具有高的胚胎存活率和高的轉基因效率［6］。

本課題組擬采用慢病毒載體法建立小型豬淋巴瘤模型。因為以小鼠為模型的實驗結果表明相對于其他實體腫瘤而言，淋巴瘤模型更容易誘發，而且耗時比較短。在淋巴瘤中，非霍奇金淋巴瘤（NHL）占多數，我國約為90%，臨床上大多數NHL為B細胞型，約占總數的70%～85%，所以本課題組基于B淋巴細胞建立轉基因豬淋巴瘤模型。

c-Myc基因最早發現于伯基特淋巴瘤患者中，是一個非常強的促癌基因，在許多類型腫瘤中的表達都上調；c-Myc蛋白屬于Myc轉錄因子家族，此家族還包括N-Myc和L-Myc基因；c-Myc被認為調節15%基因的表達。另外，已經有研究證實，在轉基因小鼠的特定臟器過表達c-Myc，可以誘導相應臟器腫瘤的發生，比如淋巴瘤、肝癌［8，9］和乳腺癌［10，11］等。而且本課題組之前研究結果顯示，單一過表達c-Myc基因就可以使小型豬胚胎成纖維細胞發生惡性轉變。此外，目前基于過表達c-Myc的轉基因小鼠和斑馬魚，已經分別建立了小鼠和斑馬魚［12］的淋巴瘤模型。本課題組擬應用慢病毒載體法，建立B細胞特異表達c-Myc的轉基因豬，以實現在轉基因小型豬B淋巴細胞特異性過表達c-Myc轉基因，進而導致轉基因小型豬發生淋巴瘤，并以期基于該轉基因豬創制淋巴瘤小型豬模型。希望能夠更加真實地揭示人類腫瘤發病情況，更真實地模擬人類腫瘤發生、發展、轉移及復發的整個動態過程，為生物制藥的研發和醫學臨床前研究提供更好的研究對象。

本研究為實現豬B淋巴細胞特異轉基因過表達c-Myc，采用人B淋巴細胞特異性啟動子Eμ-VH調控c-Myc和報告基因mRFP表達。mRFP一方面可用來監測啟動子Eμ-VH是否有活性，另一方面也有助于利用流式細胞儀分選出轉基因過表達c-Myc的細胞以做進一步相關分析。此外，載體pEMIR中亦引進了受泛表達啟動子PGK調控的報告基因GFP，GFP利于慢病毒生產和病毒滴度測定，同時借助GFP也有助于轉基因豬可視化篩選和鑒定。

本研究成功構建了人B淋巴細胞特異性啟動子Eμ-VH調控c-Myc表達的慢病毒載體pEMIR。通過pEMIR瞬時轉染293T、OCL-Ly3和OCL-Ly10細胞證實，啟動子Eμ-VH可以正常調控c-Myc和mRFP表達。數據證實載體pEMIR在人正常細胞和腫瘤細胞中均可發揮功能。總之，pEMIR的成功構建為借助慢病毒載體法制備B淋巴細胞特異過表達c-Myc的轉基因豬打下了良好基礎。

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Construction and function of a lentiviral vector harboring c-Myc gene under the control of Eμ-VH promoter

CHEN Lin，CHEN Yan，XIAO Dong

（1 Southern Medical University，Guangzhou 510515，China）

Objective To construct a lentiviral vector harboring c-Myc gene under the control of human B lymphocytespecific Eμ-VH promoter（pEMIR），and to investigate its function.Methods Firstly，taking pLV-c-Myc-IRES-EGFP as a template，after PCR amplification and enzyme digestion，we got pEVCHR.Secondly，taking plasmid pEVCHR as a template，after PCR amplification and enzyme digestion，we got a lentiviral vector pEMIR.pEMIR was transiently transfected into human embryonic kidney cells 293T and human diffuse large B-cell lymphoma cell line（OCL-LY3 or OCL-LY10）.The expression of enhanced green fluorescent protein（EGFP）and mono-red fluorescence protein（mRFP）was detected under inverted fluorescence microscope，and the expression of c-Myc mRNA and protein was detected by qRT-PCR and Western blotting.Results The electrophoresis results of Eμ--VH-c-Myc-H2BmRFP gene fragment were in agreement with the predicted value of 4129 bp，and the electrophoresis of the vector DNA showed a band that was consistent with the predicted value of 8561 bp.Enzyme digestion and DNA sequencing demonstrated that pEMIR was successfully constructed.Cells transiently transfected with pEMIR displayed the green and red fluorescence under inverted fluorescence microscope，and the expression of c-Myc was normal.Conclusion The lentiviral vector harboring c-Myc gene under the control of Eμ-VH promoter is successfully constructed，and the experiments in vitro demonstrate that it can be expressed in human normal cells and tumor cells.

Eμ-VH promoter；c-Myc oncogen；lentivirus vector；diffuse large B-cell lymphoma

10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.001

R394

A

1002-266X（2016）21-0001-03

廣東省產業技術研究與開發專項資金資助項目（2013B060300013）。

陳琳（1987-），女，在讀碩士，主要研究方向為基因在腫瘤發生發展中的作用及其機制、小型豬腫瘤模型。E-mail：1797342278＠qq.com

（2016-01-14）