強直性脊柱炎患者外周血淋巴細胞及血清PD-1、HLA-B27水平變化

宋紅林，孟保福，李艷霞，韓晶，王營偉

(安陽市人民醫院，河南安陽 455000)

強直性脊柱炎患者外周血淋巴細胞及血清PD-1、HLA-B27水平變化

宋紅林，孟保福，李艷霞，韓晶，王營偉

(安陽市人民醫院，河南安陽 455000)

目的 觀察強直性脊柱炎(AS)患者外周血淋巴細胞及血清程序性死亡受體1(PD-1)、人類白細胞抗原B27(HLA-B27)水平變化，并探討其意義。方法 選擇AS患者40例(觀察組)、同期健康體檢者40例(對照組)，采用流式細胞術檢測兩組外周血淋巴細胞膜型PD-1和HLA-B27表達率，ELISA法檢測血清可溶性PD-1和HLA-B27水平。取觀察組淋巴細胞，加入或不加入終濃度為5 μg/mL可溶性PD-1配體PD-L1，進行微量淋巴細胞毒試驗(MLCT)，對淋巴細胞死亡率進行評分。結果 觀察組和對照組外周血淋巴細胞膜型PD-1表達率比較無統計學差異(P>0.05)，觀察組外周血淋巴細胞膜型HLA-B27表達率及血清可溶性PD-1、HLA-B27水平均高于對照組(P均<0.05)。觀察組加入和不加入可溶性PD-L1的淋巴細胞MLCT評分分別為(2.63±1.24)、(3.05±1.00)分，評分比較有統計學差異(P<0.05)。結論 AS患者外周血淋巴細胞膜型PD-1表達無明顯變化，血清可溶性PD-1、HLA-B27水平均明顯升高，其發病可能與PD-1/PD-L通路介導的免疫抑制信號有關。

強直性脊柱炎；程序性死亡受體1；人類白細胞抗原B27

強直性脊柱炎(AS)是一種慢性進行性自身免疫炎癥性疾病，主要累及脊椎等中軸關節和肌腱韌帶骨附著點，致殘率高[1]。AS發病原因不明，除與人類白細胞抗原B27(HLA-B27)高度表達有關以外，免疫共刺激分子的參與，尤其是程序性死亡受體1(PD-1)等免疫負性分子失調是其發病的關鍵因素[2]。PD-1分為膜型和可溶性兩種形式，其在B細胞、樹突狀細胞和T細胞上激活后表達會增加，與兩個配體PD-L1和PD-L2結合后，介導細胞信號通路中的負性調節，協同發揮共刺激分子作用，可能與AS病情進展相關[3]。本研究觀察AS患者外周血淋巴細胞膜型PD-1、HLA-B27及血清可溶性PD-1、HLA-B27的水平變化，探討其與AS發病的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年8月～2015年7月我院收治的AS患者40例(觀察組)，男24例、女16例，年齡20～60歲、平均36歲，病程12～50個月、平均28個月。選擇同期健康體檢者40例(對照組)，男22例、女18例，年齡18～65歲、平均39歲。AS診斷均符合1984年美國紐約修定標準[4]，排除合并其他自身免疫性疾病及嚴重心、肝、腎臟疾病者[5]。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2 外周血淋巴細胞膜型PD-1及HLA-B27表達檢測 采用流式細胞術。采集兩組空腹靜脈血6 mL，其中3 mL置于不加抗凝劑的采血管中，凝集30 min；3 500 r/min離心5 min，收集血清，避免溶血和高脂血標本，分裝后置于-20 ℃冰箱保存待測。另外3 mL置于肝素抗凝采血管內，Ficoll密度梯度離心法收集外周血淋巴細胞，在5×105/mL淋巴細胞懸液中加入PE標記鼠抗人HLA-B27單抗1 μL；4 ℃結合30 min；PBS洗滌后，再加入FITC標記鼠抗人PD-1單抗1 μL，4 ℃結合30 min；PBS再次洗滌后，采用直接熒光標記法檢測膜型PD-1及HLA-B27表達率。采用Pearson積矩法分析兩組外周血淋巴細胞膜型PD-1和HLA-B27表達率的相關性。

1.3 血清可溶性PD-1及HLA-B27水平檢測 采用ELISA法。取出1.2中冰箱保存待測的血清標本，室溫融化，避免反復凍融。嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，分別檢測兩組血清可溶性PD-1和HLA-B27水平。顯色后雙波長比色，根據標準品比色數值和對應濃度繪制的標準曲線查出標本水平。采用Pearson積矩法分析兩組血清可溶性PD-1與HLA-B27水平的相關性。

1.4 可溶性PD-L1對觀察組淋巴細胞死亡情況的影響 采用微量淋巴細胞毒試驗(MLCT)。取觀察組淋巴細胞，加入或不加入終濃度為5 μg/mL可溶性PD-L1，每例樣本均設置4個平行復孔、1個陰性對照孔和1個陽性對照孔。將淋巴細胞濃度調整為1×106/mL，用微量連續加樣器將細胞懸液加入到抗血清板上，每孔1 μL，室溫孵育30 min。加入兔補體5 μL，室溫孵育1 h；加入5%伊紅2 μL，室溫反應2 min；加入36%中性甲醛固定，4 ℃培養過夜。次日于倒置顯微鏡下觀察，依據血清板對淋巴細胞死亡情況進行評分。評分標準：當陰性對照孔內淋巴細胞沒有死亡，并且陽性對照孔內淋巴細胞全部死亡時，淋巴細胞死亡率>50%記1分，≤50%記0分，4個平行復孔得分相加，為該例樣本最終得分，最高4分、最低0分。如果陰性孔內有死亡淋巴細胞或陽性孔內有成活淋巴細胞，則重復試驗。

2 結果

2.1 兩組外周血淋巴細胞膜型PD-1、HLA-B27表達率比較及關系分析 觀察組和對照組外周血淋巴細胞膜型PD-1表達率分別為7.08%±2.51%、7.29%±2.62%，兩組比較P>0.05；觀察組和對照組外周血淋巴細胞膜型HLA-B27表達率分別為64.70%±24.86%、10.47%±3.73%，兩組比較P<0.05。觀察組和對照組外周血淋巴細胞膜型PD-1、HLA-B27表達率均無明顯相關性(r分別為0.25、-0.22，P均<0.01)。

2.2 兩組血清可溶性PD-1、HLA-B27水平比較及關系分析 觀察組和對照組血清可溶性PD-1水平分別為(71.62±27.07)、(52.28±18.82)ng/mL，兩組比較P<0.05；觀察組和對照組血清可溶性HLA-B27水平分別為(58.90±16.83)、(19.13±6.95)U/mL，兩組比較P<0.05。觀察組血清可溶性PD-1與HLA-B27水平呈正相關(r=0.52，P<0.05)，對照組血清可溶性PD-1、HLA-B27水平無明顯相關性(r=-0.04，P<0.01)。

2.3 可溶性PD-L1對觀察組淋巴細胞MLCT評分的影響 觀察組加入和不加入可溶性PD-L1的淋巴細胞MLCT評分分別為(2.63±1.24)、(3.05±1.00)分，評分比較P<0.05。

3 討論

AS患者體內存在多種協同刺激分子失衡，造成免疫調節紊亂，從而導致疾病的發生、發展[6]。臨床生物標志物HLA-B27和AS的發病有密切聯系，我國AS患者HLA-B27的陽性率為90%左右[7，8]。本研究結果顯示，觀察組膜型HLA-B27表達率明顯高于對照組，但是與文獻報道的90%左右陽性率有一定差別。分析原因，可能由于本研究中樣本量較少，收集病例時間較長，不能排除已經進行治療的AS患者，因此對HLA-B27的檢測結果造成了一定影響。研究顯示，HLA-B27的表達對負性分子PD-1影響不大[9]。

HLA-B27高表達同時，可能也有其他免疫分子的變化，一般表現為免疫功能亢進，形成對骨骼關節的炎癥反應。PD-1/PD-L是B7/CD28家族中一對重要的協同刺激分子，PD-1是1992年發現的CD28超家族成員之一，由2號染色體上的PDCD1基因編碼。PD-1主要在活化的T、B和NK淋巴細胞上呈誘導性表達，隨細胞活化逐步上調表達，與其配體PD-L(PD-L1和PD-L2)相互作用，提供T淋巴細胞活化抑制信號。因此，PD-1/PD-L途徑對T淋巴細胞在免疫應答過程中發揮適當而有效的調節具有重要意義，與自身免疫、腫瘤、感染等疾病的發生也密切相關[10，11]。

除膜型PD-1外，在人外周血中還存在可溶性PD-1，而且其水平與自身免疫病的發生密切相關。本研究觀察組可溶性PD-1水平明顯高于對照組，而兩組膜型PD-1表達則沒有明顯差異。這些升高的可溶性PD-1可能來源于膜型分子，機體內一些細胞膜表面的協同刺激分子可從細胞表面裂解，并脫落成為可溶形式。另外，PD-1基因也存在多種天然的mRNA剪切體，其中缺失編碼跨膜區外顯子的剪切體，最終翻譯為可溶性PD-1蛋白。由于可溶性PD-1的增多，過度結合配體PD-L，使得配體不能充分與膜型PD-1結合，從而干擾正常的免疫抑制；免疫細胞始終處于活化狀態，持續釋放免疫激活信號，最終發生免疫炎癥反應[12]。

MLCT過程中，在分離出來的免疫細胞培養環境內，加入抑制信號分子PD-L1，可以體外模擬免疫抑制信號[13]。本研究觀察組加入可溶性PD-L1后淋巴細胞MLCT評分低于不加入可溶性PD-L1的淋巴細胞，說明可溶性PD-L1可減少淋巴細胞死亡。分析原因，可能是膜型PD-1的胞質區含有一個免疫受體酪氨酸抑制基序和一個免疫受體酪氨酸轉換基序(ITSM)，膜型PD-1結合了足夠配基PD-L1，PD-1/PD-L1相互作用后觸發ITSM募集信號分子SHP-2，引發抑制信號的產生，致使效應T細胞失去作用，導致補體介導的細胞穿孔效應缺乏必要的應答部位[14]。本研究AS患者血清可溶性PD-1與HLA-B27水平呈顯著正相關，提示AS患者血清可溶性PD-1與HLA-B27之間能夠相互調節，從而影響疾病的發生和發展[15]。

綜上所述，AS患者外周血淋巴細胞PD-1表達無明顯變化，血清可溶性PD-1、HLA-B27水平均明顯升高，其發病可能與PD-1/PD-L通路介導的免疫抑制信號有關。

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2015-12-21)