先天性顯性脊椎裂胎鼠宮內干細胞移植新方法的建立

趙桂鋒，劉波，苗佳寧，吳迪，李慧，黃天楚，袁正偉

(中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽110004)

先天性顯性脊椎裂胎鼠宮內干細胞移植新方法的建立

趙桂鋒，劉波，苗佳寧，吳迪，李慧，黃天楚，袁正偉

(中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽110004)

目的 建立一種先天性顯性脊椎裂胎鼠宮內干細胞移植的新方法。方法 選擇孕16、17、18天的雌性大鼠各30、30、26只，制備先天性顯性脊椎裂胎鼠模型。采用胎仔外科、顯微外科和顯微注射技術，將轉染綠色熒光蛋白基因的骨髓間充質干細胞(MSCs)移植到脊椎裂胎鼠脊髓中。大鼠孕20天時剖腹、取胎，計算胎鼠成活率；制作胎鼠脊髓切片，熒光顯微鏡下觀察胎鼠脊髓干細胞移植情況。結果 接受手術的孕鼠86只，孕20天成活81只，成活率為94.2%。行干細胞移植的先天性顯性脊椎裂胎鼠258只，共取出198只，成活率為76.7%(198/258)，其中胎齡為16、17、18天的胎鼠成活率分別為72.1%(80/111)、77.3%(78/101)、87.0%(40/46)。熒光顯微鏡下觀察胎鼠脊髓切片，可見呈現綠色熒光的MSCs；干細胞移植成活的胎鼠195只，成活率為98.5%(195/198)。結論 成功建立先天性顯性脊椎裂胎鼠宮內干細胞移植的新方法；該方法干細胞成活率較高，可用于神經管畸形治療。

先天性顯性脊椎裂；胚胎；顯微手術；顯微注射；骨髓間充質干細胞；移植；大鼠

先天性神經管畸形(NTDs)是一種嚴重的出生缺陷[1], 包括無腦、腦膨出、肛門直腸畸形和脊椎裂等，主要為神經管閉合異常所致。 NTDs的發病機制尚不清楚，目前認為是胚胎在母體內發育過程中多種基因調控異常和胚胎發育環境有害因素相互作用的結果[2～4]。近年來干細胞移植技術解決了中樞神經細胞不能修復和再生的難題,為神經系統疾病的治療帶來希望。2010年8月～2014年11月，我們對先天性顯性脊椎裂胎鼠模型行骨髓間充質干細胞(MSCs)移植,成功建立了NTDs胎鼠宮內干細胞移植新方法，為NTDs的干細胞治療提供思路。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 成年雌性Wistar大鼠由中國醫科大學附屬盛京醫院動物實驗室提供[合格證號：SCXK(京)2009-0004]，體質量220～250 g，在SPF級環境下飼養，陰道涂片確認未孕[5～7]。維甲酸(美國Sigma公司)，顯微鑷子、顯微剪刀、顯微針持(張家口奧斯卡醫療器械有限公司)，6-0顯微縫合線(杭州愛普醫療器械股份有限公司)，顯微注射針(美國Nikon公司)，手術顯微鏡(德國Moller公司)，手術恒溫加熱墊(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 先天性顯性脊椎裂模型建立及處理 取合籠后懷孕的雌性Wistar大鼠86只，參照李勇等[8]、蔡煒嵩等[9]的方法，于大鼠懷孕第10天上午9:00～9:30，按135 mg/kg給予4%維甲酸灌胃,采用顯微外科及胎仔外科技術制備先天性顯性脊椎裂胎鼠模型(以下稱脊椎裂胎鼠)。取孕16、17、18天的大鼠各30、30、26只，10%水合氯醛按0.32 mL/100 g腹腔麻醉，仰臥位固定于手術加熱墊上(預設38 ℃)，肛門直腸內測溫。調整手術顯微鏡及座椅，大鼠常規腹部消毒，腹部正中開腹，暴露雙側子宮角，術野外圍鋪溫鹽水紗布。將一側子宮角輕輕拉出放置于紗布上，清點胚胎數量，確認胚胎頭尾位置，調整胚胎子宮部位至手術顯微鏡視野內。鏡下確認胎鼠脊椎裂部位，于對應子宮壁部位做一預置縫線荷包[10]。逐層剪開子宮壁長約2 mm，暴露羊膜，輕輕推壓子宮壁，調整脊椎裂位置至清晰暴露于鏡下術野(此時手術顯微鏡放大倍數為20倍，可清晰見到胎鼠的脊髓)，滴加37 ℃預熱溫生理鹽水保溫、保濕。

1.3 胎鼠脊髓MSCs的綠色熒光蛋白基因轉染及移植 參照楊洋等[11]、李志勇等[12]的方法，于無菌條件下取4周齡大鼠的MSCs,采用全骨髓貼壁細胞培養法進行原代培養,腺病毒-EGFP(感染復數為300～500)轉染。暴露孕鼠羊膜，采用獨立口吸顯微注射技術[13]抽吸轉染綠色熒光蛋白基因的MSCs約2 μL。將顯微注射針移至鏡下術野，迅速刺入羊膜，輕劃羊膜，使羊水外流。對準脊髓，進針約2 mm，針頭保持2 s，緩慢后退針頭并吹出干細胞。干細胞完全注入后，保持針頭在組織內不動，同時保持注射針內壓力，停止2 s，減少因組織壓力導致移植干細胞的外溢，之后迅速退出針頭(顯微注射完畢)。輕拉預先縫合在子宮壁上的荷包縫線，打結縫合，檢查子宮壁修復情況，必要時加針縫合加固。將子宮輕輕推回腹腔，并輕輕擠壓腹壁，使其歸位并避免腸梗阻。其他胚胎間隔給予同樣操作后關腹。

1.4 相關指標觀察

1.4.1 胎鼠成活情況 取接受干細胞移植的孕20天大鼠，10%水合氯醛按0.32 mL/100 g腹腔麻醉，固定于手術托盤中。常規腹部消毒，腹部正中開腹，暴露雙側子宮角，術野外圍鋪溫鹽水紗布。將一側子宮角輕輕拉出放置在紗布上，清點胚胎數量，按照手術記錄查找接受建模的胚胎。打開子宮壁，剖出胚胎，以胚胎有心跳及活動記為胎鼠成活。計算不同孕齡大鼠的胎鼠成活率。

1.4.2 干細胞移植成活情況 將經干細胞移植的成活胎鼠脊髓避光小心剝離取出，OCT包埋、避光冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察移植干細胞，以出現綠色熒光視為干細胞移植成活，計算干細胞移植胎鼠成活率。

2 結果

接受手術的孕鼠86只，孕20天成活81只，孕鼠成活率為94.2%。行干細胞移植的脊椎裂胎鼠258只，共取出接受干細胞移植的胎鼠198只，成活率為76.7%(198/258)；其中胎齡為16、17、18天的胎鼠成活率分別為72.1%(80/111)、77.3%(78/101)、87.0%(40/46)。熒光顯微鏡下觀察，胎鼠脊髓切片可見呈現綠色熒光的MSCs，見插頁Ⅱ圖1。干細胞移植成活的胎鼠195只，成活率為98.5%(195/198)，證明干細胞移植成功。

3 討論

目前, NTDs的治療尚無突破性進展,主要原因為神經損傷的修復極其困難。近年來干細胞移植已深入到各方面科研研究中[14，15]。本研究利用顯微注射、顯微外科和胎仔外科技術，將轉染綠色熒光蛋白基因的MSCs移植入脊椎裂胎鼠的脊髓損傷部位,在大鼠孕20天剖腹取出胎鼠，干細胞成活率為98.5%。因此，我們認為采用本研究方法對脊椎裂胎鼠進行干細胞移植具有較高的干細胞成活率，可作為研究NTDs治療的方法之一，同時也為其他神經系統損傷進行干細胞移植治療提供研究方向。現將經驗總結如下。

3.1 顯微手術技巧 手術時間的長短直接影響到胚胎的成活率，因此本研究并沒有采用以往先手術后縫線的常規操作，而是預先在手術部位做一個縫線荷包，使手術時間大大縮短，一只胎鼠手術用時僅為2～3 min。手術過程中子宮壁開口大小是胚胎是否會被擠出的關鍵，我們的體會是開口不要超過5 mm。另外本研究注射干細胞前僅將子宮壁打開，并沒有直接刺破羊膜，一定程度上縮短了在準備干細胞注射過程中胚胎暴露于空氣中的時間，同時降低了子宮壁收縮壓力過大導致胚胎被擠出的風險，亦是提高胎鼠成活率的重要手段。

3.2 顯微注射技巧 干細胞注射完畢后外溢是顯微注射操作的一大難題，本研究對此操作進行了改良。首先，本研究采用單人吹吸顯微注射法，優點為無雙人操作是否配合默契的問題；可根據自身呼吸控制注射針內壓力，從而控制干細胞的注入速度，也可以輕松控制細胞流速與退針的速度。其次，進針后保持2 s及退針后針尖在組織內保持2 s的做法，使干細胞外溢的可能性大大降低。脊髓本身厚度約為1.5 mm，皮膚及肌肉厚度約為1 mm，本研究保持進針深度約為2 mm，在這個深度注射干細胞能夠確保干細胞成功注入脊髓。

3.3 術中與術后動物護理 由于體溫調節中樞紊亂，動物麻醉后會發生低體溫，極易導致死亡[16，17]。本研究使用了手術加熱墊，保持動物體溫在37～38 ℃。溫濕中孔紗布溫度也保持在37～38 ℃，能夠維持子宮角溫度；此外，術中不斷向子宮角滴加預熱溫生理鹽水，不僅可以避免子宮角暴露于空氣中，也可以保持子宮所需的溫度及濕度。為降低手術時間及胎鼠死亡率，本研究將每只孕鼠手術的胚胎數控制為3～5只，且間隔進行手術操作，保證從開腹到關腹時間控制在30 min以內。子宮回納到腹腔后，輕輕擠壓腹壁可以使子宮角及腸道回歸原位，避免術后出現腸梗阻。

本研究中胎齡16、17、18天的脊椎裂胎鼠干細胞移植后成活率分別為72.1%、77.3%、87.0%，為干細胞移植治療先天性顯性脊椎裂的最佳時機提供依據。本研究總的胎鼠成活率僅為76.7%，說明該技術仍存在很大的提升空間。

總之，采用顯微注射、顯微外科和胎仔外科技術對脊椎裂胎鼠進行干細胞移植治療的成功率較高。關于干細胞移植治療先天性顯性脊椎裂的療效及其機制仍需進一步研究。

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A new method of stem cell transplantation in utero for rats with congenital dominant spine bifida

ZHAOGuifeng,LIUBo,MIAOJianing,WUDi,LIHui,HUANGTianchu,YUANZhengwei

(ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Shengyang110004,China)

Objective To establish a novel method of stem cell transplantation in utero for rats with congenital dominant spine bifida. Methods Thirty pregnant female rats (16 days, E16), 30 pregnant female rats (17 days, E17) and 26 pregnant female rats (18 days, E18) were selected to establish the animal models of congenital dominant spine bifida. The bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) transfected with green fluorescent protein (GFP) gene were subsequently transplanted into spinal cord of pregnant rats with congenital dominant spine bifida by fetal surgery, microsurgery and microinjection. The E20 pregnant rats were killed and embryo biopsy was performed to count fetal rat survival rate. The spinal cord stem cell transplantation in fetal rat was observed under the fluorescence microscope. Results The survival rate was 94.2% (81/86) for E20 pregnant rats receiving surgery. One hundred ninety-eight embryo rats with stem cell transplantation survived in 258 rats with congenital spinal bifida fetal, whose survival rate was 76.7% (198/258). The survival rates were 72.1% (80/111), 77.3% (78/101) and 87.0% (40/46) in E16, E17, and E18 fetal rates receiving stem cell transplantation. The GFP was observed in embryo spinal cord under fluorescence microscopy. The survival rate of MSCs was 98.5% (195/198). Conclusions We successfully establish an new method of stem cell transplantation in utero for rats with congenital dominant spine bifida and its stem cell survival rate is high. This method can be used as one of the methods in treatment of neural tube defects.

congenital dominant spine bifida; embryo; microsurgery; microinjection; bone marrow mesenchymal stem cells; transplantation; rats

國家自然科學基金資助項目(81171072)。

趙桂鋒(1983-)，男，助理實驗師，研究方向為動物顯微手術。E-mail： animal_lab@yeah.net

袁正偉(1964-)，男，教授，研究方向為小兒先天畸形。E-mail： yuanzw@sj-hospital.org

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.003

R682.1

A

1002-266X(2016)16-0008-03

2015-11-12)