瑞香狼毒抗腫瘤作用機制研究進展

宋海平，任韶韶，肖超，宋琪，孫京棟，馬學真

（青島市腫瘤醫院，山東青島266042）

瑞香狼毒抗腫瘤作用機制研究進展

宋海平，任韶韶，肖超，宋琪，孫京棟，馬學真

（青島市腫瘤醫院，山東青島266042）

瑞香狼毒為藥用狼毒的正品，具有抗腫瘤作用。其作用機制包括調節腫瘤細胞周期、抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡、調整免疫細胞功能、逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥等多個方面。

瑞香狼毒；狼毒；抗腫瘤

瑞香狼毒為瑞香科植物瑞香狼毒的根，又名斷腸草、山蘿卜、紅狼毒，為藥用狼毒的正品，盛產于河北、山西、四川等地，其性味苦、平、辛，有大毒，入肝、肺、脾三經。瑞香狼毒治療腫瘤在我國古代醫學典籍中早有記載，《本經》有“狼毒破積聚，治惡瘡，消蠱毒”的論述，又有“逐水、祛痰、破積、殺蟲”之功效。近年來國內外學者對瑞香狼毒進行了深入系統地研究，認為瑞香狼毒在抗腫瘤研究中的藥理實驗較多，是一種很有前途的抗腫瘤藥物。現對瑞香狼毒的抗腫瘤作用機制作一綜述。

1　瑞香狼毒可調節腫瘤細胞周期

細胞周期受多種因子調控，如周期調控蛋白、細胞周期蛋白依賴性激酶、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑等。正常細胞在G1期進入S期，G2期進入M期處均有控制點，DNA損害較輕時，通過內切酶的修復，細胞周期正常進行；DNA損害嚴重時，不能修復，則啟動細胞凋亡程序。腫瘤細胞缺乏這種細胞周期的控制，DNA異常仍能繼續繁殖［1，2］。腫瘤作為一種細胞周期疾病，是細胞周期調控紊亂、細胞失控性生長的結果。阻滯細胞周期，是抗腫瘤藥物的重要作用方式。

王潤田等［3］應用瑞香狼毒甲醇提取物，體外作用于K562細胞，可減少G2、M期細胞數量，增加G0／G1細胞數量，阻滯細胞周期，抑制腫瘤細胞分裂增殖。段盺等［4］報道不同濃度的瑞香狼毒總黃酮微波無水乙醇提取物作用于人肺癌A549細胞48 h后，G0／G1期細胞增加，S和G2／M期減少，表明瑞香狼毒總黃酮提取物可使細胞阻滯于G1期。王敏等［5］研究發現，瑞香狼毒80%乙醇提取物，以鹽酸沉淀，氨水析出，獲得總含量68.24%總生物堿，對體外培養的人胃癌細胞SGC-7901有明顯G1期阻滯作用，表明瑞香狼毒總生物堿可使細胞停滯于有絲分裂前期。

2　瑞香狼毒可抑制腫瘤細胞增殖

細胞增殖失控是腫瘤細胞的基本生物學特征之一，腫瘤細胞理論上具有無限增殖的能力。腫瘤細胞的增殖包括速度增快、接觸抑制減弱、形態改變等。申彥等［6］報道，瑞香狼毒水提取物可抑制膀胱癌T24細胞的生長，用MTT法檢測細胞的吸光度及抑制率，發現提取物濃度越高、作用時間越長，抑制作用越明顯。段盺等［4］報道，瑞香狼毒總黃酮無水乙醇提取物對人肺癌A549細胞有抑制作用，隨著藥物濃度增加，作用時間延長，抑制效果顯著增強。采用80 mg／L濃度提取物作用A549細胞72 h后，采用MTT法檢測細胞活性，細胞增殖抑制率可高達79.3%。王敏等［5］發現，瑞香狼毒總生物堿對體外培養人胃癌細胞SGC-7901、人肝癌細胞BEL-7402有較強的抑制作用，作用略強于長春新堿，并有較好的劑量依賴性。對人白血病細胞HL-60抑制作用弱于長春新堿。王玉華等［7］將瑞香狼毒水提取物經鹽析、透析后獲得瑞香狼毒總蛋白，作用于人肝癌SMMC-7221細胞和狗腎MDCK細胞，濃度4 mg／mL時，同時呈現抗腫瘤活性和細胞毒性，且隨濃度增加，作用加強。提示蛋白質可能是瑞香狼毒的主要毒性位點。同時發現，瑞香狼毒不同溶劑的提取物均有抗腫瘤活性，證實其細胞毒作用是多種成分協同作用的結果。

闞曉溪等［8］報道，瑞香狼毒乙醇提取物雙二氫黃酮類化合物對人肺癌細胞A549抑制作用強于肝癌細胞，抑制率為（60.57±3.83）%～（96.66± 0.51）%，推測肺癌可能是瑞香狼毒的主治癌癥之一。Zhang等［9］報道瑞香狼毒的單體成分狼毒素B和狼毒素C具有抑制多種實體瘤細胞增殖的作用。楊乾栩等［10］報道，瑞香狼毒80%乙醇提取物中活性成分狼毒寧B在50、100 μg／mL時，作用于人肺癌細胞A549，與陽性對照藥物DDP，具有相同的腫瘤細胞抑制率。藥物呈典型的S型濃度藥效曲線，與DDP的雙曲線型濃度藥效曲線不同，推測可能具有不同的藥物作用方式。汪群紅等［11］報道用瑞香狼毒乙醇提取物新狼毒素A喂飼雄激素非依賴性前列腺癌荷瘤裸鼠，可顯著抑制裸鼠移植瘤的生長，抑制率達56.5%。毛剛等［12］用瑞香狼毒水提取物給小鼠灌胃后獲得狼毒血清，可顯著降低膀胱癌T24細胞的增殖。

研究發現，在多數腫瘤細胞中，端粒酶均有高表達，認為其與腫瘤細胞無限增殖的能力有關。抑制端粒酶的活性，可以達到抑制腫瘤細胞增殖的目的。劉芳等［13］發現，瑞香狼毒水提取物作用于人肺癌細胞NCI446，可減少端粒酶數量，作用強度與藥物濃度呈正相關。瑞香狼毒作為一種傳統中藥，在我國有廣泛的應用。各種民間驗方及配合抗腫瘤化療藥物的應用，也取得了良好的效果。段盺等［14］應用瑞香狼毒揮發物注射液肌內注射4 mL，每日2次，聯合吉西他濱+DDP方案化療，治療中晚期肺小細胞肺癌，較單獨應用化療藥物，有效率明顯提高，1年生存率達75%，明顯抑制腫瘤生長。

3　瑞香狼毒可促進腫瘤細胞凋亡

細胞凋亡是一個主動、有序、基因控制的由一系列酶參與的細胞程序性死亡過程，是保證個體正常發育成熟和維持生理過程中的不可或缺的重要組成。腫瘤的發生發展不僅與細胞過度增殖有關，也與細胞凋亡減少有關。細胞凋亡是腫瘤發展的主要負性調控因素，可阻止腫瘤的迅速增長。瑞香狼毒可以通過激活機體抗腫瘤給基因，增加不同凋亡基因表達，達到誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤生長的作用。段盺等［4］報道，瑞香狼毒總黃酮無水乙醇提取物作用于肺癌細胞A549 48 h后，流式細胞儀檢測細胞凋亡，提取物濃度80 mg／L時，細胞凋亡率顯著高于對照組（P＜0.05）。

Survivin是細胞凋亡抑制蛋白，具有高度的保守性和明顯抗細胞凋亡作用，在大部分腫瘤細胞中高表達。Survivin可通過結合活性半胱氨酸的天冬氨酸水解酶3（Caspase-3）和Caspase-7產生直接抑制作用，也可通過細胞周期抑制蛋白P21間接抑制Caspase而阻止細胞凋亡。申彥等［4］報道瑞香狼毒水提取物在體外可增加膀胱癌T24細胞的凋亡，1.5 g／mL時，凋亡率可達（57.57±3.77）%，并下調細胞中Survivin蛋白的表達，且具有時間、濃度依賴性。

細胞凋亡途徑主要包括：死亡受體途徑、線粒體途徑、內質網應激途徑。線粒體參與了大多數細胞的凋亡過程。目前公認凋亡后期的共同途徑由Caspases蛋白酶家族激活。死亡受體途徑：由細胞外腫瘤壞死因子（TNF）超家族的死亡配體激活，配體與細胞表面死亡受體結合，使受體三聚化并活化Caspase-8，釋放入細胞質，啟動Caspase的級聯反應，激活下游的Caspase-3，6，7，導致細胞凋亡。細胞表面的死亡受體很多，其中經典的有Fas受體和其配體Fas-L；腫瘤壞死因子相關凋亡配體受體（TRAIL-R）和其配體TNF-α。腫瘤細胞表面Fas受體表達增多可促進凋亡，腫瘤細胞內源性Fas-L配體表達增高則有利于腫瘤的生成和轉移。TNF-α是目前發現的抗腫瘤活性最強的細胞因子。TNF-α通過與TNFR結合，激活Caspase-8、核因子κB（NF-κB）和JNK信號通路、改變線粒體的通透性等方法誘導腫瘤細胞凋亡。線粒體途徑：當細胞內死亡受體非依賴的凋亡刺激轉導到線粒體時，線粒體膜電位下降，外膜形成多聚Bax孔道，線粒體內容物如細胞色素C（Cyt-C）、Smac／DLABLO、凋亡誘導因子等蛋白和鈣離子流出進入細胞質，引起變構活化Caspase-9，激活下游Caspase-3，6，7，引發級聯反應，導致細胞凋亡［15］。同時也可以直接作用于細胞核，引起細胞凋亡。mac／DLABLO蛋白通過拮抗凋亡抑制蛋白，促進凋亡反應的速度和強度，使凋亡順利進行。Cyt-C在進一步激活Caspase-3的過程中處于核心地位。劉曉霓等［16］報道，采用Annexin V／PI雙標法檢測肺癌細胞NCI-H157細胞凋亡，瑞香狼毒無水乙醇提取物（ESC、ESC-1、ESC-2）可明顯提高NCI-157的凋亡率，上調Fas、TNF-α蛋白的表達，Cyt-C表達無明顯影響。ESC可提高Caspase-3，8酶的活性，顯著上調Fas-L。ESC-2可提高Caspase-3，8，9酶的活性。ESC-1可顯著下調Fas-L、TRAIL-R蛋白的表達；ESC-1、ESC-2可下調Smac蛋白的表達，與其促凋亡作用不一致。提示瑞香狼毒誘導腫瘤細胞凋亡機制復雜，可能存在雙向調節作用，是綜合調控凋亡通路蛋白表達的結果。

Bcl-2是Bcl-2家族最重要的抗凋亡基因，其編碼的Bcl-2蛋白廣泛存在于多種腫瘤細胞，主要分布在線粒體外膜、細胞膜內表面、內質網及核膜等處。Bcl-2抗凋亡的機制包括：拮抗促凋亡基因Bax；抑制促凋亡蛋白質Cyt-C自線粒體釋放到細胞質；阻止胞質中的Cyt-C激活Caspase；抗氧化及維持細胞內鈣穩態（與內質網應激凋亡途徑相關）等。Bax基因屬于Bcl-2基因家族，是極其重要的促凋亡因素，其編碼的Bax蛋白可與Bcl-2形成二聚體，對Bcl-2產生抑制作用。Bax／Bcl-2的比例是決定細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素。Bcl-2基因啟動子具有NF-κB結合位點并受其調控，故NF-κB可通過活化誘導Bcl-2等抗凋亡基因而阻止細胞凋亡。NF-κB也通過刺激IL-1β轉化酶、C-myc和TNF-α基因表達而導致細胞凋亡。周維等［17］研究發現，用蛋白質印跡法檢測技術，體外應用瑞香狼毒水提取物，可通過減少膀胱癌Biu-87細胞的Bcl-2表達，來抑制腫瘤細胞增殖，促進其凋亡。馬曉莉等［18］報道，酒制瑞香狼毒與生藥相比，采用昆明小鼠，給腹水型肝癌細胞株荷瘤小鼠灌胃，可明顯抑制腫瘤生長，提高Bax蛋白表達，降低Bcl-2蛋白表達，從而促進腫瘤細胞凋亡。同時提高小鼠體質量，胸腺、脾臟質量無明顯下降。

4　瑞香狼毒可調整免疫細胞功能

機體免疫系統具有殺傷腫瘤細胞的能力，腫瘤在長期形成過程中，具有多種免疫逃逸機制。通過免疫刺激劑和免疫調節劑恢復、提高免疫系統對腫瘤細胞的識別、提高體液免疫，是腫瘤防治的重要舉措。

張坤娟等［19］研究表明，瑞香狼毒甲醇提取物體外可刺激脾臟細胞增殖，協同ConA刺激對小鼠脾細胞轉化。體內可增加小鼠殺傷細胞活性，從而提高細胞免疫功能。樊俊杰等［20］研究發現，瑞香狼毒的水提乙醇沉淀物（主要成分為狼毒多糖）給小鼠灌胃7 d，同時腹腔注射環磷酰胺，檢測小鼠免疫功能變化。結果顯示：狼毒多糖可顯著提高環磷酰胺免疫抑制小鼠的胸腺重量、腹腔吞噬細胞的活性、凝集素滴度、血清溶血素CH50值、小鼠足墊遲發超敏反應。提示瑞香狼毒可提高小鼠非特異性、細胞及體液免疫功能。崔立然等［21］報道用狼毒多糖給移植肉瘤S180荷瘤小鼠灌胃10 d，可增加刀豆蛋白A／脂多糖誘導的荷瘤小鼠T／B淋巴細胞的有絲分裂作用，顯著增強有絲分裂原誘導的T／B淋巴細胞增殖，增強荷瘤小鼠免疫應答能力，降低血清中轉化生長因子β1（TGF-β1）水平，TGF-β1是一種強效免疫抑制劑，是抑制T細胞增殖及細胞毒活性的主要介導者，稱為T細胞抑制因子。狼毒多糖同時增加荷瘤小鼠外周血中細胞毒T淋巴細胞CD8+T的表達，CD8+T是特異性殺傷細胞，作用強，可持續殺傷。狼毒多糖通過激活免疫細胞，降低免疫抑制因子，增強特異性腫瘤殺傷細胞免疫應答，來降低腫瘤免疫逃逸，增強荷瘤機體的免疫監視功能。

5　瑞香狼毒可逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥

腫瘤細胞多藥耐藥（MDR）是腫瘤化療失敗的主要原因之一，瑞香狼毒多糖可通過逆轉化療藥物的耐藥，來增強抗腫瘤作用。馬健等［22］通過5-FU篩選，誘導出對阿霉素、阿糖胞苷均耐藥的肝癌細胞Bel5-FU2000。以瑞香狼毒水提取物給小鼠灌胃，得到其藥物血清。藥物血清可顯著提高阿霉素和阿糖胞苷對肝癌耐藥細胞Bel5-FU2000的抑制率，從而逆轉耐藥。

MDR1編碼的p糖蛋白（Pgp）是跨膜轉運蛋白超家族成員，為能量依賴性，能將細胞內帶陽性電荷的親脂類化療藥物逆濃度泵至細胞外，使得細胞內化療藥物達不到有效濃度而產生耐藥。Pgp高表達被認為是產生多藥耐藥的最主要原因。多藥耐藥相關蛋白（MRP）與肺癌耐藥相關蛋白（LRP）表達增高也被認為與腫瘤多藥耐藥有關。李鴻君等［23］報道瑞香狼毒水提取物，終濃度5 g／mL生藥，聯合DDP分別與人肺腺癌細胞株A549、人肺腺癌耐藥細胞株A549／DDP共孵育，較單獨應用DDP，對耐藥細胞株有明顯抑制作用，抑制作用有時間、濃度效應關系。瑞香狼毒和DDP聯合用藥前，A549和A549／DDP細胞MRP1表達水平差異有統計學意義，聯合用藥后MRP1表達水平差異無統計學意義。瑞香狼毒和DDP聯合用藥前，A549細胞MRP1的mRNA水平顯著低于A549／DDP細胞，聯合用藥后，兩者差異無統計學意義。即瑞香狼毒通過下調MRP1 mRNA表達水平和MRP1蛋白的表達，逆轉肺癌細胞株對DDP耐藥。進一步推測瑞香狼毒逆轉耐藥可能是通過影響跨膜轉運蛋白功能而發揮作用。邢立強等［24］報道應用瑞香狼毒水提取物，作用于人小細胞肺癌NCI-H1446和人非小細胞肺癌NCI-H157，用免疫組化SP法分別測定用藥前后癌細胞中多藥耐藥相關蛋白（MDM2）、LRP、熱休克蛋白（HSP 27）的表達。結果顯示水提取物可抑制NCI-H1446、MDM2、NCI-H157、LRP、HSP27的表達。提示臨床應用治療肺癌，有可能逆轉耐藥，增強化療藥物的療效。

綜上所述，瑞香狼毒可通過多種分子生物學機制抑制腫瘤的發生發展。這些機制相互聯系、相互影響。通過現代抗腫瘤藥物篩選機制，篩選瑞香狼毒的有效抗腫瘤單體成分，闡明瑞香狼毒的抗腫瘤作用機制，摸索臨床應用的合理劑量，還需進一步深入研究。

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10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.040

R286；R730.5

A

1002-266X（2016）21-0098-04

馬學真（E-mail：18660229289＠126.com）

（2016-03-27）