Nrf2-Keap1信號通路對腫瘤生物學行為影響的研究進展

韓倫，趙琳

(1撫順市礦務(wù)局總醫(yī)院，遼寧撫順 113000；2中國醫(yī)科大學藥理學教研室)

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Nrf2-Keap1信號通路對腫瘤生物學行為影響的研究進展

韓倫1，趙琳2

(1撫順市礦務(wù)局總醫(yī)院，遼寧撫順 113000；2中國醫(yī)科大學藥理學教研室)

核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是細胞調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2與其接頭蛋白Keap1是細胞抗氧化反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)者。當體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時，Nrf2與錨定蛋白Keap1發(fā)生解聚，解聚后的Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)相互作用，可增加ARE調(diào)控的Ⅱ相氧化還原代謝酶活性并上調(diào)抗氧化反應(yīng)基因表達水平，從而增加細胞抵抗氧化應(yīng)激的能力。近年來相關(guān)領(lǐng)域研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nrf2-Keap1在惡性腫瘤表達明顯增加，Nrf2-Keap1信號通路在腫瘤發(fā)生、進展、遷移以及化療敏感等方面發(fā)揮重要作用，現(xiàn)將其研究進展綜述如下。

核因子E2相關(guān)因子2；錨定蛋白Keap1；信號通路；腫瘤；生物學行為

近年來隨著環(huán)境污染的加劇、人們飲食結(jié)構(gòu)的改變以及遺傳等內(nèi)在因素的影響，惡性腫瘤的發(fā)病率和病死率呈逐年升高趨勢。腫瘤相關(guān)基因信號通路成為研究熱點。前期的研究結(jié)果提示，核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)及其接頭蛋白Keap1是細胞抗氧化反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)者，Nrf2-Keap1信號通路在腫瘤發(fā)生、進展、遷移以及化療敏感等方面發(fā)揮重要作用[1]。本文就Nrf2-Keap1信號通路基本結(jié)構(gòu)與功能及其對腫瘤的生物學行為、放化療敏感性影響的研究進展作一綜述。

1 Nrf2-Keap1信號通路的基本結(jié)構(gòu)與功能

1.1 Nrf2的基本結(jié)構(gòu)與功能 Nrf2分子量為66～68 kD，機體各種組織細胞中均可見Nrf2表達。Nrf2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中包含1個基本的亮氨酸結(jié)構(gòu)域，在人體表達中，Nrf2基因包含重要的6個活性功能區(qū)域，Neh1～6。Neh1功能區(qū)包含1個可與小Maf蛋白形成異二聚體的拉鏈結(jié)構(gòu)bZIP，bZIP與Maf形成的異二聚體幫助Nrf2識別抗氧化反應(yīng)元件(ARE)上特定DNA序列并與之結(jié)合，繼而達到上調(diào)下游目的靶基因轉(zhuǎn)錄水平目的。Neh2功能區(qū)與細胞質(zhì)錨定蛋白Keap1相結(jié)合，Neh2上的ETGE缺失或突變會解除Nrf2和Keap1相互作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，當小鼠被敲除Nrf2基因后，多種基因(如環(huán)氧化水解酶、GCL、GSTs、HO-1、醌氧化還原)的表達水平都會降低，而上述基因能清除體內(nèi)氧自由基、生物毒性以及致癌物等，消除此類毒性物質(zhì)可減少核酸及生物活性蛋白質(zhì)的破壞，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。之前的研究結(jié)果顯示，Nrf2作為轉(zhuǎn)錄因子在抵抗細胞對抗外來異物和減輕氧化損傷中發(fā)揮重要作用[2]。Nrf2表達水平下降或缺失，會導(dǎo)致細胞對應(yīng)激源敏感性升高；而細胞敏感性升高與癌癥進展、細胞凋亡以及炎癥修復(fù)時間延長等病理過程密切相關(guān)。

1.2 Nrf2的轉(zhuǎn)錄活化 Nrf2蛋白Neh4和Neh5功能區(qū)的第494位、511位及545和554位之間的氨基酸殘基具有細胞核信號傳遞和雙向核轉(zhuǎn)位調(diào)節(jié)功能。Neh4功能區(qū)包含一個轉(zhuǎn)錄連接器基序結(jié)合序列，可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[3]。Neh5功能區(qū)與p45NF-E2結(jié)構(gòu)上高度相似，可與CREB結(jié)合蛋白(CBP)相互作用。在所有家族成員中，Nrf2對目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能最強，可將靶基因轉(zhuǎn)錄活性提高100倍左右，其強效上調(diào)轉(zhuǎn)錄能力可能與Neh4-CBP和Neh5-CBP的協(xié)同作用相關(guān)[4]。Zhang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2結(jié)構(gòu)與生物學活性的穩(wěn)態(tài)，與Keap1參與Nrf2泛素化作用相關(guān)，C273及C288兩個半胱氨酸位點在泛素化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

降解決定子(degrons結(jié)構(gòu))通常由氨基酸序列和(或)一個特別的蛋白質(zhì)構(gòu)象結(jié)合而成，降解決定子參與泛素化依賴蛋白酶介導(dǎo)的蛋白降解過程的關(guān)鍵反應(yīng)步驟：E3泛素化連接酶必須先對降解決定子識別并結(jié)合相互作用。Nrf2的降解決定子是位于Neh2區(qū)的絲氨酸殘基，正常生理狀態(tài)下，Neh2區(qū)的降解決定子與E3泛素化連接酶復(fù)合物Keapl結(jié)合，呈非活化的降解狀態(tài)。氧化應(yīng)激發(fā)生時，降解決定子因磷酸化而發(fā)生構(gòu)象改變，泛素化依賴蛋白酶對Nrf2的識別能力減弱，結(jié)合及復(fù)合物形成減少，Nrf2降解減少，其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性相應(yīng)增強。Nrf2泛素化調(diào)節(jié)機制與P53穩(wěn)定機制相似。正常生理狀態(tài)下，P53與Mdm2蛋白-E3連接酶結(jié)合成為泛素化依賴的降解蛋白酶作用的目標底物，表達水平降低，呈非活化狀態(tài)。應(yīng)激反應(yīng)及核酸損傷修復(fù)過程中，P53蛋白Ser-20位點發(fā)生磷酸化，P53與Mdm2的相互作用減弱，從而P53降解減少，穩(wěn)定性及生物學活性升高。以往研究表明，蛋白激酶C(PKC)家族中的眾多成員可使Nrf2發(fā)生磷酸化，作用位點在Nrf2的Ser-40[6]。

1.3 Keap1的基本結(jié)構(gòu)與功能 Keap1是相對分子量為69 kD的蛋白質(zhì)，Keap1蛋白質(zhì)與果蠅肌動蛋白Kelch在結(jié)構(gòu)上具有相似性而得名。Keap1蛋白DGR功能區(qū)包含6個雙甘氨酸重復(fù)序列，DGR功能區(qū)負責結(jié)合Nrf2以及胞質(zhì)內(nèi)肌動蛋白，進而發(fā)揮生物學功能[7]。生理條件下，Nrf2被Keap1局限在胞質(zhì)中，外源氧化劑或親電試劑或氧化劑影響下，Nrf2與Keap1發(fā)生解偶聯(lián)，Nrf2轉(zhuǎn)移進入細胞核，結(jié)合Maf蛋白成異二聚體。Nrf2-Maf異二聚體協(xié)助識別并結(jié)合ARE，進而激活目標代謝酶并上調(diào)抗氧化應(yīng)激基因轉(zhuǎn)錄水平，實現(xiàn)細胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化還原平衡后，Keap1穿梭至細胞核內(nèi)，將Nrf2協(xié)同轉(zhuǎn)運回到細胞質(zhì)后降解Nrf2，此循環(huán)實現(xiàn)Nrf2-Keap1信號傳導(dǎo)通路[8]。

1.4 Nrf2-Keap1信號通路的調(diào)節(jié)機制 氧化應(yīng)激反應(yīng)的誘因有很多，主要包括外源性藥物、重金屬、氧化劑以及電離輻射等理化因素[9]。氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)物活性氧和親核物質(zhì)可誘發(fā)機體急、慢性炎癥、動脈粥樣硬化、神經(jīng)系統(tǒng)病變、甚至惡性腫瘤等疾病。生理條件下，Nrf2與Keap1的結(jié)合定位于細胞質(zhì)中，被活性氧和親核物質(zhì)激活后，通過細胞外信號途徑，主要包括磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)、PKC以及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑，致使Nrf2磷酸化而活化。Nrf2從Keap1中解離，進入細胞核內(nèi)，激活后的Nrf2進而達到基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的功能。Kobayashi等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Keap1的IVR區(qū)可與CuB結(jié)合，成為E3泛素化連接酶復(fù)合物的一部分；同時Keap1本身就具備泛素化連接酶生理活性。生理狀態(tài)下，Keapl與Nrf2結(jié)合，局限表達于細胞質(zhì)，Nrf2處于非游離及不斷降解的非活性狀態(tài)。Keapl蛋白C273和C288半胱氨酸位點被認為是結(jié)合Nrf2并限定其活性的分子基礎(chǔ)。C273和C288這兩個位點中任何一個發(fā)生突變，針對Nrf2蛋白質(zhì)的泛素化作用即會消除。外源氧化反應(yīng)誘導(dǎo)因子可作用于C273、C288位點，引發(fā)Keapl構(gòu)象改變。與Nrf2的耦聯(lián)作用力減弱，對Nrf2的泛素化作用消除，故細胞裂解液中可見Nrf2含量增加、半衰期明顯延長。

1.5 Nrf2-Keap1信號通路與抗氧化系統(tǒng) 機體氧化應(yīng)激反應(yīng)誘發(fā)的異常蛋白質(zhì)的聚集，可導(dǎo)致神經(jīng)退行性改變以及細胞損傷，目前研究證實Nrf2-Keap1信號通路在細胞抵御外源性或內(nèi)源性氧化應(yīng)激的機制中的重要地位。Kwak等[11]發(fā)現(xiàn)編碼蛋白酶亞單位的基因是Nrf2-Keap1信號通路的下游靶基因，應(yīng)用一種植物源性抗氧化劑處理肝臟組織，實驗結(jié)果顯示，處理后肝臟組織中抗氧化相關(guān)蛋白酶活性升高，而對照組Nrf2缺失小鼠無此現(xiàn)象，這一實驗結(jié)果可成為Nrf2參與蛋白酶亞單位基因調(diào)控的又一有力證據(jù)。這一結(jié)果初步揭示，Nrf2介導(dǎo)細胞抵抗氧化應(yīng)激的作用機制主要是調(diào)控蛋白酶亞單位基因表達水平，活化蛋白酶，降解氧化應(yīng)激引起的異常蛋白[12]。

2 Nrf2-Keap1信號通路對腫瘤生物學行為的影響

2.1 Nrf2-Keap1信號通路與腫瘤的發(fā)生 目前的研究已證明，多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中可見Nrf2基因表達水平的下降或無表達，是腫瘤易感性的一個重要的因素[13]。Nrf2蛋白對防止異源性破壞DNA而致癌發(fā)揮著重要的保護機制。Nrf2功能的誘導(dǎo)劑可作為阻斷劑，阻止致癌因子與靶目標基因相互作用，抑制致癌物的產(chǎn)生及活化，防止致癌因子與重要的生物大分子如核酸和蛋白質(zhì)等相互作用。甲基汞這一公認的致癌物質(zhì)可激活Nrf2，Nrf2的激活可以促進甲基汞進入細胞間隙排泄并降解。Morito等[14]的研究也發(fā)現(xiàn)，敲除Nrf2基因的小鼠血液中亞硝基胺濃度明顯增高，增加了小鼠發(fā)生惡性腫瘤的風險。Keap1-Nrf2調(diào)控系統(tǒng)中，Keap1對Nrf2的抑制對氧化還原Ⅱ相代謝酶的調(diào)節(jié)具有很重要的作用，氧化還原Ⅱ相代謝酶可以通過結(jié)合反應(yīng)來減少過氧化物對機體的損害。敲除Keap1的小鼠，其血液內(nèi)的氧化還原Ⅱ相代謝酶含量明顯增高，大部分小鼠在出生3周后死亡，大部分小鼠死于食管和胃的過度角化。在同時敲除Nrf2基因的情況下，可逆轉(zhuǎn)Keap1敲除后所引起的發(fā)育缺陷出現(xiàn)，表明Keap1負性調(diào)控Nrf2是機體必須的。

2.2 Nrf2-Keap1信號通路與惡性腫瘤耐藥性 Yomamoto等[15]研究者最早發(fā)現(xiàn)Nrf2-Keap1信號通路在維持細胞氧化還原平衡，防御外源性有害物及致癌物過程中發(fā)揮重要作用。但近來研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2可通過降低腫瘤細胞化療敏感性起到腫瘤細胞保護作用，比如誘導(dǎo)耐藥的產(chǎn)生該信號通路的下游基因，如HMOX-1、GPx及Prx1等都與腫瘤細胞泵出藥物有關(guān)。該信號通路參與多藥耐藥蛋白(MRPI-2)的調(diào)節(jié)，而MRPI-2與多種惡性腫瘤的多藥耐藥性直接相關(guān)。此外，Nrf2還可與HO-1相互作用，引起細胞耐藥。目前Nrf2-Keap1信號通路在腫瘤耐藥中作用機制尚處于起步階段，但已有實驗證實，下調(diào)Nrf2表達后可提高多種惡性腫瘤細胞如乳腺癌細胞、結(jié)直腸癌細胞及肺癌細胞對相應(yīng)化療藥物的敏感性[16]。在進一步的研究中檢測Nrf2下游相關(guān)蛋白的表達變化可為臨床診療提供新的藥敏及腫瘤標記物，為腫瘤藥物的耐藥逆轉(zhuǎn)劑的研發(fā)提供有力的理論基礎(chǔ)，提高腫瘤的化療敏感性，改善惡性腫瘤的預(yù)后。

2.3 Nrf2-Keap1信號通路與惡性腫瘤的預(yù)防 植物來源的強Nrf2的誘導(dǎo)劑包括萊菔硫烷、姜黃素、表兒茶素酯、白藜蘆醇、咖啡酸苯乙醋、咖啡醇和咖啡白、番茄紅素；一些合成的化學藥品如奧替普拉、CDDO及其衍生物CDDO-Im也是強Nrf2誘導(dǎo)劑。這些化學預(yù)防復(fù)合物發(fā)揮作用的機制涉及誘導(dǎo)Nrf2依賴的適應(yīng)性，調(diào)節(jié)氧化還原Ⅱ相代謝酶水平、抗氧化和防止細胞隨后發(fā)展成腫瘤的運載體等[17]。

2.4 Nrf2-Keap1信號通路對腫瘤的保護作用 Nrf2-Keap1信號通路可同時保護正常細胞和腫瘤細胞免于氧化應(yīng)激的破壞。多種腫瘤細胞系或組織標本中可檢測到Keap1基因突變或Keap1基因表達水平的異常下調(diào)，Keap1突變及表達異常可保護腫瘤細胞，促進其增殖進展，作用機制可能是Nrf2蛋白表達水平升高及其下游基因的轉(zhuǎn)錄激活。肺癌研究中可見肺腺癌患者的Keap1體細胞突變率增高，不能有效控制Nrf2的功能。Keap1功能缺失會導(dǎo)致Nrf2過度表達，促進惡性腫瘤生長[18]。

綜上所述，在未來腫瘤的個體化治療中，抑制Nrf2的活性與表達將成為極具潛力的治療方法。

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