Cereblon在多發性骨髓瘤中的研究進展及臨床意義

趙永峰，王　仙

荊州市第一人民醫院血液科，湖北 荊州 434000

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*通信作者

Cereblon在多發性骨髓瘤中的研究進展及臨床意義

趙永峰，王仙*

荊州市第一人民醫院血液科，湖北 荊州 434000

[摘要]以沙利度胺、來那度胺、泊馬度胺為代表的免疫調節藥物，對于多發性骨髓瘤患者的治療反應率及預后產生了重要影響。Cereblon(CRBN)，最初發現與常染色體隱性遺傳非綜合征性智力發育遲緩相關，近年研究已經證明其不僅為沙利度胺致畸作用的靶點，還與免疫調節藥物抗骨髓瘤作用的臨床反應率及患者的生存時間相關；目前認為，CRBN可能是通過形成DDB1-CUL4-ROC1泛素連接酶復合物介導抗骨髓瘤活性。還需要更多有關CRBN分子機制及臨床相關性研究以促進免疫調節藥物耐藥機制的進一步發展以及更有效、低毒性的藥物出現，提高多發性骨髓瘤患者的生存質量。

[關鍵詞]多發性骨髓瘤；免疫調節藥物；Cereblon

0引言

多發性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是一種惡性漿細胞腫瘤，以貧血、腎功能損害、反復感染、溶骨性骨破壞等為臨床表現，多發生于中、老年人。免疫調節藥物是多發性骨髓瘤治療方案中的重要基石，其對患者臨床緩解率的提高以及生存期的延長產生了重要影響。

Cereblon(CRBN)作為沙利度胺致畸作用的主要分子靶標而被發現，其對探討免疫調節藥物在多發性骨髓瘤中的作用機制具有重要意義，且近年來多數研究報道其與多發性骨髓瘤患者的反應率和生存期相關。為了解CRBN與多發性骨髓瘤的臨床相關性以及可能的作用機制，筆者對其在多發性骨髓瘤中的相關研究作簡要綜述。

1CRBN與免疫調節藥物的發現

1.1CRBN的發現CRBN基因位于3p染色體，作為輕型智力發育遲緩家族中編碼ATP依賴的Lon蛋白酶的基因而首次被發現[1]。廣泛分布于不同的組織，尤其是在腦組織中存在高水平表達，通過對腦組織裂解物的免疫沉淀，發現其可與大電導鈣離子激活鉀通道(Large-conductance calcium-activated potassium channel，BKCa)α亞單位細胞溶質內的羧基末端直接相互作用，干擾該通道四聚體的組裝及細胞表面表達；此外,CRBN的Lon結構域可與視網膜電壓門控性氯離子通道(ClC-2)羧基端的遠側區相互作用[2-3]。Ito等[4]通過使用高性能的磁珠以及親和純化的方法，發現沙利度胺與CRBN蛋白結合，作為Cul4-DDB1 E3泛素連接酶復合物的底物受體發揮功能，第一次證明了CRBN可能為沙利度胺致畸作用的重要靶點,該發現對于沙利度胺作用機制的研究具有里程碑式的意義。

1.2三代免疫調節藥物的發現沙利度胺為第一代免疫調節藥物，其用藥史經歷了多重轉變：于上世紀50年代合成，在歐洲和加拿大，因為其幫助睡眠及鎮吐作用作為非處方藥而廣泛應用；1961年德國“海豹肢癥”生長缺陷嬰兒數量的增加，使其撤出市場；幾年之后，發現其可用于麻風病的治療，于1998年在美國再次被應用于臨床；1999年，Singhal等[5]首次將沙利度胺作為單藥用于治療難治性多發性骨髓瘤患者,顯示了較好的臨床有效性；隨后進行了大量關于沙利度胺單藥或聯合地塞米松治療難治或復發性多發性骨髓瘤的臨床試驗。沙利度胺隨后被來那度胺取代，來那度胺為一個毒性較低但活性較高的衍生物，2006年被FDA批準與地塞米松聯合用于治療復發或難治性多發性骨髓瘤。2013年，第三代免疫調節藥物泊馬度胺被批準用于經包括來那度胺及硼替佐米至少兩種藥物治療在內的復發/難治性多發性骨髓瘤患者。

2免疫調節藥物治療多發性骨髓瘤的相關研究

1999年，Singhal等[5]首次將沙利度胺用于治療多發性骨髓瘤，給藥劑量為200～800 mg/d，中位給藥天數為80 d，經治療的總反應率為32%，隨后進行了許多關于沙利度胺治療難治或復發多發性骨髓瘤的臨床試驗[6-7]。2006年美國FDA批準比沙利度胺活性強的衍生物-來那度胺用于多發性骨髓瘤的治療；無論單用來那度胺，還是與其他藥物聯合，對復發或難治性多發性骨髓瘤均具有較好的臨床反應性，且無進展生存時間延長，不良反應主要是粒細胞減少、血小板減少及靜脈血栓形成等[8-9]。2013年2月被FDA批準的治療多發性骨髓瘤的新藥泊馬度胺，適用于在來那度胺或硼替佐米治療過程中或者末次治療結束的60 d內病情進展的多發性骨髓瘤患者。Ⅰ～Ⅲ期臨床，臨床反應率及生存時間令人欣慰[10-12]，尤其是Ⅱ、Ⅲ期泊馬度胺聯合地塞米松的多中心臨床研究結果顯示：泊馬度胺聯合低劑量地塞米松治療組無論與泊馬度胺單藥治療相比，還是與高劑量地塞米松單藥治療相比，中位無進展生存時間均延長，差異有統計學意義。泊馬度胺聯合低劑量地塞米松的治療方案可作為復發或難治性多發性骨髓瘤患者的新選擇。

3CRBN在多發性骨髓瘤中的臨床意義

3.1CRBN及相關蛋白對于免疫調節藥物活性的必要性免疫調節藥物改善了多發性骨髓瘤患者的預后，但是其作用機制一直尚未闡明。近年來，CRBN的發現，為理解該類藥物的作用機制奠定了重要基礎，多項研究證明，CRBN為該類藥物發揮作用的重要條件，似乎可以稱其為免疫調節藥物結合分子，可能與其抗骨髓瘤活性以及藥物耐藥相關。

Zhu等[13]首次將多發性骨髓瘤與CRBN的表達聯系起來，通過利用預先設計的CRBN shRNA慢病毒表達載體感染人類多發性骨髓瘤細胞系，發現感染后的細胞CRBN表達明顯降低，細胞活性降低65%～78%；檢測0～30%的感染后存活細胞在抗骨髓瘤藥物存在條件下的生長情況，發現CRBN缺失可以誘導細胞對抗骨髓瘤藥物的耐藥，但是并沒有對不相關的藥物如硼替佐米、地塞米松以及美法侖發生耐藥。進一步通過shRNA進行CRBN基因敲除，可誘導多發性骨髓瘤細胞系IRF4基因及蛋白表達水平的下調，提示CRBN的下游分子靶標可能包括了干擾素調節因子4(Interferon regulatory factor 4，IRF4)。IRF4在成熟的漿細胞上大量表達，并且在B細胞的分化過程中發揮重要作用，與骨髓瘤患者的生存率相關[14]。

上述有關CRBN對于免疫調節藥物抗骨髓瘤活性的重要性及其表達水平與藥物耐藥的相關性在Lopez-Girona等[15]的研究中同樣得到了證實：shRNA可以誘導U266細胞系CRBN表達水平的降低，這些低水平表達CRBN的細胞對來那度胺的敏感性低；來那度胺耐藥的細胞系H929細胞系同樣存在CRBN水平的降低，泊馬度胺及來那度胺均耐藥的細胞系DF15R中，CRBN水平無法檢測。上述幾項研究證明，CRBN可能為直接與來那度胺及泊馬度胺治療意義相關的分子靶標，且研究者對下游分子通路進行了初步探討，CRBN可能通過形成CRBN-DDB1-CUL4復合物而介導其抗骨髓瘤活性。

3.2CRBN與多發性骨髓瘤患者臨床反應率及生存時間的相關性Heintel等[16]通過對使用來那度胺及地塞米松治療的49份新診斷多發性骨髓瘤患者的骨髓樣本通過實時聚合酶鏈反應行CRBN表達的檢測：正常骨髓組織的CRBN表達設置為1；發生完全反應CR的患者中位CRBN表達值確定為3.45；非常好的部分反應VGPR、部分反應PR、疾病穩定SD以及疾病進展PD的中位CRBN表達分別為3.75、2.01、0.78、0.70，即未發生反應患者的CRBN表達水平低于正常骨髓組織。此外，反應患者與非反應患者相比，CRBN表達水平與來那度胺治療的反應性顯著相關(r=0.48，P<0.001)；在明確的預后參數中，只有β2微球蛋白與CRBN表達顯著相關(r=0.66，P<0.001)；CRBN表達與IRF4(r=0.57，P<0.001)、CTNNB1(r=0.7，P<0.001)存在比較緊密的聯系；Cox回歸分析并沒有發現與無進展生存時間及總生存時間的相關性。

總之，該研究證明CRBN表達與來那度胺治療的多發性骨髓瘤患者的臨床反應性具有統計學意義的相關性。

Broyl等[17]研究者對參加HOVON-65/GMMG-HD4臨床試驗的新診斷多發性骨髓瘤患者進行CRBN基因檢測分析，并對其與患者的臨床反應率及生存時間進行相關性研究：單變量Cox回歸分析表明，CRBN基因表達與無進展生存時間(P=0.005)及總生存時間(P=0.04)顯著相關；使用Kaplan-Meier進一步分析表明，CRBN表達在中位數以上與中位數以下相比較，存在較長的無進展生存時間(P=0.009)；多變量Cox回歸分析表明，較高的CRBN表達水平與較長的無進展生存時間顯著相關，與總生存時間無此相關性；但該研究并沒有發現CRBN表達水平與臨床反應率改善之間的相關性。

另外的一項研究不僅肯定了CRBN表達水平與臨床反應率之間的相關性，同時證明其可能與患者的生存時間相關：77例接受免疫調節藥物聯合地塞米松治療的患者中有14例患者存在CRBN中位表達<0.8,而這些患者中沒有一例對治療發生反應；CRBN表達0.8～0.9患者的反應率為40%；CRBN表達>0.9患者的反應率為49%；中位CRBN表達≥0.889與<0.889患者之間的無進展生存時間(3.0個月vs.8.9個月,P=0.000 6)及總生存時間(9.1個月vs.27.2個月,P=0.01)之間差異具有統計學意義，但是在多藥聯合化療組尚未發現此相關性[18]。

3.3CRBN在多發性骨髓瘤中相關分子機制的研究泛素化修飾在腫瘤的發生發展中具有重要作用，其中E3泛素連接酶Cullin4A( CUL4A)能夠通過與DDB1相結合而泛素化多種底物，介導其降解，這種酶通過調節DNA的修復、復制和轉錄，從而在腫瘤的發生過程中發揮關鍵作用。多數有關CRBN與多發性骨髓瘤的相關性研究證明了CRBN通過結合DDB1-CUL4-ROC1，形成泛素連接酶多蛋白復合物而介導免疫調節藥物發揮抗骨髓瘤活性，并且對該復合物的可能下游分子靶標進行了相關實驗研究。

Kr?nke等[19]使用SILAC為基礎的定量質譜研究分析多發性骨髓瘤細胞系MM1S經來那度胺處理后細胞內相關蛋白的變化情況，發現來那度胺結合DDB1、CRBN，與CUL4、ROC1共同形成E3泛素連接酶，增加了B細胞轉錄因子Ikaros家族鋅指蛋白1和3(Ikaros family zinc finger proteins 1、3，IKZF1、IKZF3)與CRBN-DDB1泛素連接酶的結合，誘導其降解，且為劑量依賴性，并且通過突變的CRBN證明了CRBN對于IKZF1和IKZF3調節的重要性；同時發現了1個58個氨基酸序列的敏感區，且該結構存在于鋅指結構域2，該結構域中氨基酸的變化可以引起對來那度胺不同的敏感性。

來那度胺與CRBN結合，從而獲得了降解IKZF1和IKZF3的能力，Lu等[20]的研究也證實了該結論。Zhu等[21]通過使用慢病毒表達載體感染人類多發性骨髓瘤細胞，共發現了244種CRBN的結合蛋白，并且通過在來那度胺治療后含量的變化情況，確定了其與多發性骨髓瘤的生物學相關性，發現在來那度胺治療后，46種CRBN結合蛋白含量降低，IKZF1在3/5種的免疫調節藥物耐藥的細胞系明顯降低；在44例使用泊馬度胺及地塞米松治療的耐藥多發性骨髓瘤患者存在較低的IKZF1基因表達水平，預示著對治療缺乏反應；除此之外，還發現IKZF1與KPNA2水平同樣與總生存率方面的區別相關。

4小結

通過對上述有關CRBN與免疫調節藥物抗骨髓瘤相關性的研究進行綜述，發現免疫調節藥物顯著改善了多發性骨髓瘤患者的反應率及生存率，改變多發性骨髓瘤治療的革命化時代正在到來。還希望更多有關CRBN高純度抗體及其晶體結構的研究，以促進藥物耐藥機制的進一步發展，以及更有效的、低毒性的藥物出現，尤其是非致畸性的免疫調節藥物。除此之外，需要大樣本、多中心的CRBN與多發性骨髓瘤患者臨床反應率及生存時間的相關性研究以驗證其檢測價值。

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Advances and clinical importance of cereblon in multiple myeloma

ZHAO Yong-feng,WANG Xian*

(Department of Hematology,the First People′s Hospital of Jingzhou,Jingzhou 434000,China)

[Abstract]The immunomodulatory drugs,including thalidomide,lenalidomide and pomalidomide,play an important part in treatment response and prognosis of patients with multiple myeloma.Cereblon (CRBN) was first found to be associated with autosomal recessive non-syndromic mental retardation.There were studies which discovered that it not only was the teratogenic target of the immunomodulatory drugs,but also was associated with clinical response rate of these drugs in multiple myeloma and the patients′ survival time.It is presumed that CRBN probably mediates anti-myeloma activity by binding to DDB1-CUL4-ROC1 and forming an E3 ubiquitin ligase complex.Many studies about the molecular mechanism and clinical associativity of CRBN are needed to pave the way to an developed understanding of drug resistance of immunomodulatory drugs and the appearance of more effective,hypotoxic drugs,thereby advancing the quality of life for patients with multiple myeloma.

Key words：Multiple myeloma;Immunomodulatory drugs;Cereblon

收稿日期：2015-08-13

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201604036