通心絡膠囊對糖尿病周圍神經病變KK/Up j-Ay小鼠血管生成的影響

王 超， 王 曉， 張會欣， 邢邯英， 王 杏， 劉 敏， 張 哲

（1.河北省人民醫院老年醫學重點實驗室，河北石家莊050051；2.河北以嶺醫藥研究院藥理室，河北石家莊050035）

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通心絡膠囊對糖尿病周圍神經病變KK/Up j-Ay小鼠血管生成的影響

王 超1， 王 曉1， 張會欣2*， 邢邯英1， 王 杏1， 劉 敏1， 張 哲1

（1.河北省人民醫院老年醫學重點實驗室，河北石家莊050051；2.河北以嶺醫藥研究院藥理室，河北石家莊050035）

摘要：目的 觀察通心絡膠囊對糖尿病周圍神經病變KK/Upj-Ay小鼠血管生成的影響。方法 KK/Upj-Ay小鼠隨機分為模型組、通心絡高劑量組、通心絡中劑量組和通心絡低劑量組，另設C57BL/6小鼠為對照組。灌胃給藥12周，測定熱痛覺閾值和運動神經傳導速度（MNCV）；放免法測定血液中內皮素（ET）、血栓素A2（TXA2）和前列環素（PGI2）含有量；Rea1Time PCR（qPCR）和Western b1ot法測定坐骨神經造血祖細胞抗原（CD34）、血管性血友病因子（VWF）和血管內皮生長因子（VEGF）表達。結果 與對照組比較，模型組熱痛覺閾值明顯降低，MNCV明顯減慢（P＜0.01）；ET和TXA2含有量顯著升高（P＜0.01）；小鼠坐骨神經CD34、VWF、VEGFmRNA和蛋白表達顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，通心絡組小鼠痛覺閾值升高，MNCV明顯增快（P＜0.05，P＜0.01）；ET和TXA2含有量明顯降低，PGI2含有量上升（P＜0.05，P＜0.01）；CD34、VWF、VEGF mRNA和蛋白表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。結論 通心絡膠囊可調節血管活性因子、升高CD34、VWF、VEGF表達，改善糖尿病周圍神經病變。

關鍵詞：通心絡膠囊；糖尿病周圍神經病變；CD34；VWF；VEGF

近年來，盡管糖尿病周圍神經病變（DPN）在發病機制和治療方面取得了很大進展，但其機制仍未闡明，藥物治療也并不十分理想，開發療效確切的新藥仍是DPN研究的重要課題［1］。本實驗采用由人參、水蛭、全蝎等12味中藥材組方的具有通絡止痛，益氣活血功效的藥物通心絡膠囊進行干預［2-3］。臨床研究發現，通心絡對于糖尿病周圍神經病變患者的神經癥狀和體征有明顯改善作用，能夠顯著提高周圍神經傳導速度［4-5］，而DPN的發生發展與微血管病變、血管生成等血管因素密切相關［6］。本實驗采用DPN小鼠，用通心絡膠囊加以干預，觀察通心絡膠囊對DPN坐骨神經血管生成的影響，為深入了解DPN的作用機制以及臨床用藥提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 動物 10只25～30 g的SPF級雄性C57BL/6小鼠；40 只30～40 g的SPF級雄性KK/Upj-Ay小鼠。均購自于北京華阜康生物公司，動物合格證號SCXK-（京）2009-0004。

1.2 藥品與試劑 通心絡膠囊（石家莊以嶺藥業股份有限公司，批號20110501）；內皮素（ET）、血栓素A2（TXA2）和前列環素（PGI2）放免試劑盒購自北京東亞免疫技術研究所；上海生工生物技術公司合成造血祖細胞抗原（CD34）、血管性血友病因子（VWF）和血管內皮生長因子（VEGF）引物；CD34、VWF和VEGF一抗由Abcam公司生產。

1.3 儀器 7300熒光定量PCR儀采購于ABI公司；凝膠成像分析儀為Biorad公司生產；GC-1200 γ全自動放免分析儀購自中科中佳公司；PowerLab生理記錄儀購自AD Instrument公司。

1.4 動物分組與給藥 按照空腹血糖值（FBG）把KK/ Upj-Ay小鼠（40只）平均分為模型組，通心絡高、中、低劑量組，10只C57BL/6小鼠設為對照組。連續12周，通心絡高、中、低劑量組每日灌胃給予通心絡膠囊，分別相當于4、2、1 g生藥/kg；對照組與模型組每日根據小鼠體質量，給予相同體積純水［2］。

1.5 熱痛覺閾值測定和坐骨神經傳導速度（MNCV）測定最后一次給藥結束后，測定小鼠熱痛覺閾值。以小鼠于55℃恒溫熱板儀上的舔足反應潛伏期作為痛覺閾值。MNCV在小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，連接PowerLab生理記錄儀測得。于小鼠右側坐骨切跡，踝部與左足底第2趾間分別插入刺激電極與兩個記錄電極，每隔1 min記錄一次雙通道復合動作電位，取3次的平均值進行計算［7-9］（MNCV=兩對記錄電極間距離除以兩通道復合動作電位潛伏期之差［10］）。

1.6 FBG、ET、TXA2和PGI2含有量測定 最后一次給藥后，用微量血糖儀測定小鼠FBG水平；按放免試劑盒說明書操作測定ET、TXA2和PGI2水平。

1.7 熒光定量PCR方法測定CD34、VWF和VEGFmRNA的表達 按照實驗標準操作步驟提取小鼠新鮮坐骨神經組織總RNA，參照試劑盒說明加樣后進行逆轉錄反應，之后再采用熒光定量qPCR儀進行擴增。內參Gapdh與目的基因引物設計如下。

CD34引物：正向為5′-GCCTGGAACTAAGTGAAGCAT-3′，反向為5′-GCCAAGACCATCAGCAAAC-3′，產物片段175 bp。VWF引物：正向為5′-CCTGGTGGTAGACTTCGGAA-3′，反向為5′-GCAAACCTGGTCAAGCGT-3′，產物片段108 bp。Vegf引物：正向為5′-TGTCTATCAAGGGAGTGTGTGC-3′，反向為5′-TGGAGTATTTCCGTGACCG-3′，產物片段150 bp。內參照Gapdh引物：正向為5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3′，反向為5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3′，產物片段143 bp。用儀器自帶的分析軟件，將對照組設定為1，以相對定量值RQ作為數據進行統計分析。

1.8 Western b1ot法檢測CD34、VWF和VEGF蛋白的表達

提取小鼠坐骨神經總蛋白，進行半干法轉膜，封閉后按照標準操作步驟依次加入CD34、VWF、VEGF和GAPDH的一抗以及二抗，顯影后掃描條帶分析其吸光度值，并以CD34、VWF、VEGF與GAPDH的吸光度比值進行數據統計［9］。

1.9 統計學分析 應用SPSS 11.5軟件進行ANOVA分析和Dunnett檢驗處理數據，結果以±s的形式表示。

2 結果

2.1 各組小鼠FBG的變化 給藥12周后，各組小鼠FBG均有變化。與對照組相比，模型組FBG升高明顯（P＜0.01）；與模型組相比，通心絡組FBG有下降趨勢，但無統計學差異（P＞0.05）。見表1。

表1　各組小鼠FBG的變化（±s，n=10）

表1　各組小鼠FBG的變化（±s，n=10）

注：與對照組比較，**P＜0.01

組別　　劑量/ （g.kg-1）FBG/（mmo1.L-1）給藥前　　第12周對照組-　5.33±0.81　 5.51±0.88模型組　-　 14.83±2.66**　17.54±2.79**通心絡低劑量組　1　 14.72±2.78　 16.46±2.44通心絡中劑量組　2　 14.64±2.61　 15.84±1.86通心絡高劑量組4　 14.86±2.31　 14.97±2.27

2.2 各組小鼠痛覺閾值及MNCV變化 模型組與對照組小鼠相比，痛覺閾值明顯降低，MNCV明顯減慢（P＜0.01）；與模型組相比，通心絡中、高劑量組痛覺閾值明顯上升，MNCV明顯增快（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2　各組小鼠痛覺閾值及MNCV的變化（±s，n=10）

表2　各組小鼠痛覺閾值及MNCV的變化（±s，n=10）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別　　劑量/ （g.kg-1）痛覺閾值/ （m.s-1）MNCV/ （m.s-1）對照組-　16.99±2.00　 24.44±0.06模型組　-　8.82±1.22**　5.43±1.01**通心絡低劑量組　1　9.64±1.50　 6.16±1.12通心絡中劑量組　2　11.50±1.85#　7.82±1.63#通心絡高劑量組　4　12.63±2.19##　9.54±1.77##

表3　各組小鼠血液中ET、TXA2和PGI2含有量的變化（±s，n=10）

表3　各組小鼠血液中ET、TXA2和PGI2含有量的變化（±s，n=10）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別　　劑量/（g.kg-1）　ET-1/（pg.L-1）　TXA2/（pg.L-1）　PGI2/（pg.mL-1）對照組57.18±10.34　247.16±36.61　88.79±15.69模型組　-　71.06±10.53**　305.22±41.19**　97.10±14.83通心絡低劑量組　1　66.92±10.94　280.80±43.92　118.03±19.04#通心絡中劑量組　2　62.86±7.00　278.04±29.08　136.53±23.95##通心絡高劑量組　4　61.58±7.65#　261.27±30.71##　122.54±17.63 -##

2.3 各組小鼠血液中ET、TXA2和PGI2含有量的變化與對照組比較，模型組小鼠ET和TXA2含有量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，通心絡高劑量組ET和TXA2含有量明顯降低，通心絡組PGI2含有量明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

2.4 坐骨神經CD34、VWF、VEGFmRNA表達變化 模型

組CD34、VWF、Vegf mRNA表達明顯比對照組下調（P＜0.01）；通心絡中、高劑量組CD34、VWF、Vegf mRNA表達均比模型組顯著上升（P＜0.05，P＜0.01）。見表4。

表4　各組小鼠坐骨神經CD34、VW F、Vegf m RNA表達的變化（±s，n=3）

表4　各組小鼠坐骨神經CD34、VW F、Vegf m RNA表達的變化（±s，n=3）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

Vegf對照組組別　CD34　VWF 0.90±0.09　 1.16±0.20　 1.15±0.13模型組　0.36±0.06**0.37±0.08**　0.30±0.03**通心絡低劑量組0.34±0.02　 0.49±0.08　 0.35±0.04通心絡中劑量組　0.65±0.06##0.61±0.10#　0.70±0.07##通心絡高劑量組　0.67±0.06##0.70±0.13##　0.75±0.07##

2.5 坐骨神經CD34、VWF、VEGF蛋白表達變化 模型組CD34、VWF、VEGF蛋白表達明顯低于對照組（P＜0.01）；與模型組比較，通心絡組CD34蛋白表達顯著上升，中、高劑量組VWF、VEGF蛋白表達也均顯著上升（P＜0.05，P＜0.01）。見表5、圖1。

表5　各組小鼠坐骨神經CD34、VW F、VEGF的蛋白表達（±s，n=3）

表5　各組小鼠坐骨神經CD34、VW F、VEGF的蛋白表達（±s，n=3）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

CD34　VWF　VEGF對照組組別0.97±0.13　 1.27±0.20　 0.79±0.09模型組　0.29±0.03**0.42±0.06**　0.28±0.05**通心絡低劑量組　0.40±0.06#0.53±0.08　 0.36±0.06通心絡中劑量組　0.45±0.07#　0.68±0.10#　0.53±0.09#通心絡高劑量組　0.68±0.12#　0.76±0.12#　0.66±0.10##

1.對照組 2.模型組 3.通心絡低劑量組 4.通心絡中劑量組 5.通心絡高劑量組圖1　各組W estern blot結果

3 討論

在本實驗中，我們采用了具有高血糖、高胰島素抵抗特點的自發性II型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠，該小鼠表現出低的痛覺閾值及減慢的神經傳導速度，可作為DPN動物模型［11］。我們前期實驗結果也觀察到了光鏡電鏡下可見坐骨神經毛細血管內皮腫脹，管腔狹窄，表明DPN小鼠存在神經內膜血管病變［12］。

血管障礙、血流動力學變化及血管活性物質減少等是神經微血管病變的重要表現。ET是已知的強血管收縮劑，ET大量釋放可通過影響血流動力學的改變參與微血管病變的發病機制［13］。TXA2是一種重要的縮血管物質，而PGI2是一種重要的抑制血管收縮物質，兩者之間的動態平衡失調最終導致缺血、缺氧性神經損害。臨床研究發現，DPN患者給予前列腺素E1治療能顯著改善患者的神經系統癥狀［14］。因TXA2、PGI2非常容易自發水解成穩定的代謝產物：TXB2與6-Keto-PGF1a，所以測定TXB2、6-K-PGF1a的含有量可以分別反映TXA2和PGI2的含有量［15］。我們實驗發現DPN小鼠TXA2/PGI2的平衡被破壞，給予通心絡膠囊治療后，血液中ET-1水平下降，TXA2代謝物TXB2含有量下降，PGI2代謝物6-K-PGF1 a含有量上升，表明通心絡膠囊通過降低ET-1水平、調節TXA2/PGI2穩態，改善受損周圍神經微血管病變，提高神經傳導速度。

CD34、VWF分別是毛細血管和較大管徑血管標記物［16 -17］，文獻報道CD34抗原的表達與細胞增殖關系十分密切［18］，CD34抗原對血管生成期間的內皮細胞的黏附和/或轉移有一定的影響［19］。VWF主要由血管內皮細胞合成，能夠促進血小板黏附至內皮下結構［20］。我們實驗發現DPN小鼠坐骨神經內的CD34、VWF的蛋白和基因表達均下降，通心絡膠囊干預后能明顯上調CD34、VWF表達，提示通心絡膠囊通過促進CD34、VWF表達，促進坐骨神經中血管形成。VEGF是血管內皮生長因子，能促進不同來源內皮細胞分裂增殖，促使內皮細胞遷移，誘導血管生成［21］，臨床上常用血管擴張藥改善糖尿病患者血流不足和提高神經傳導速度［22］。通心絡治療后能夠顯著上調DPN小鼠坐骨神經VEGF的水平，提示我們通心絡可能通過升高VEGF表達，促進周圍神經中毛細血管新生，進而改善DPN。

綜上所述，通心絡膠囊可以通過調節血管活性因子、升高CD34、VWF、VEGF表達，改善周圍神經微血管病變，促進血管形成，提高神經傳導速度，阻滯DPN的發生發展。但我們應看到中醫藥治療糖尿病周圍神經病變是在整體觀念下的多靶點、多途徑的治療，因此，進行系統全面深入的作用機制研究才能真正地為臨床中藥研發提供理論基礎。

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*通信作者：張會欣（1976—），女，博士，從事抗糖尿病藥物研究。Te1：（0311）85901715，E-mai1：hxzhang76@sohu.com

作者簡介：王 超（1975—），男，博士，從事老年病研究。Te1：（0311）85988007，E-mai1：cwyx163@163.com

基金項目：十二五“重大新藥創制”科技重大專項（2011ZX09101-004-02）；河北省中醫藥管理局科研計劃項目（2014155）

收稿日期：2014-08-27

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.040

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）01-0173-04