microRNA在睪丸腫瘤中的最新進展

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microRNA在睪丸腫瘤中的最新進展

譚于龍綜述錢輝軍審校

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關鍵詞：微小RNA；睪丸腫瘤；生物標志物

在世界范圍，睪丸腫瘤是泌尿生殖系統少見的腫瘤之一，只占泌尿生殖系統腫瘤的5%左右。然而，20~35歲的年輕男性睪丸腫瘤的發病率高于其他腫瘤。在我國，睪丸腫瘤占泌尿生殖系統的3%~9%[1]。2004年國際衛生組織(WHO)將睪丸腫瘤的病理亞型分為：生殖細胞腫瘤(包括精原細胞瘤、卵黃囊瘤、畸胎瘤等)；性索/性腺間質腫瘤(包括間質細胞瘤、支持細胞瘤等)；其他非特異性間質腫瘤。超過95%的睪丸癌為睪丸生殖細胞腫瘤(testicular germ cell tumor/TGCT)。睪丸癌多為單側發病，雙側發病者僅占1%左右。目前對睪丸腫瘤的發病機制還不十分清楚，危險因素包括隱睪或睪丸下降不全、家族遺傳因素、Klinefelter綜合征等。近年來，遺傳學研究的不斷進步，改善了臨床上對睪丸腫瘤的診斷和治療。表觀遺傳學研究作為遺傳學研究的新分支，有望為睪丸腫瘤的診斷及分型、制定治療方案和監測治療效果、預測預后帶來一場革命。

1microRNA的合成、運輸及作用機制

隨著對人類基因組認識的不斷加深，我們現在認識到，只有不到2%的基因是由編碼區(外顯子)組成的，而這些編碼區就是合成mRNA的模版[2]。過去認為余下的基因沒有生物功能，然而，近20年來，這些非編碼區的功能被不斷發掘出來，對應的RNA命名為非編碼RNA(non-coding RNA)[3]，其中一類稱為微小RNA(microRNA/miRNA)。原始miRNA(primary miRNA/pri-miRNA)是莖環樣結構，由RNA聚合酶Ⅱ轉錄得到，有多種miRNA基因定位于編碼基因的內含子，其中的CpG島是miRNA轉錄的啟動子，此外，DNA甲基化可以導致RNA聚合酶Ⅱ基因沉默。原始miRNA在細胞核內通過微處理器剪切為獨立的發夾樣結構，稱之為前體miRNA，然后通過exportin-5(輸出蛋白5)的協助運輸到細胞質，經Dicer剪切為長度19～22個核苷酸的成熟miRNA[4]。在細胞質內，miRNA完全或部分互補結合到靶mRNA，可以形成RNA誘導的沉默復合物(RISC)，控制mRNA的降解或轉錄后翻譯抑制，最終調節靶基因的表達[5]。每種miRNA可以調控多種mRNA，并且每種mRNA也都受到多種miRNA的調控。據估計，人類有30%～70%的基因受miRNA調控[6]。研究表明，miRNA不僅參與正常的生理過程，如細胞分化、發育時序的控制、細胞凋亡、細胞增殖等等，還涉及一些病理過程，例如腫瘤的發生[7]。

Voorhoeve等發現，在野生型p53存在的情況下，表達miR-372和miR-373的細胞，可以對抗DNA損傷而防止衰老。對這個機制進一步的探討，發現miR-372和miR-373可以結合到p53的下游區域，并模仿無活性p53的功能[8]。鑒于腫瘤抑制因子2(large tumor suppressor 2，LATS2)刪失可以加速細胞增殖并最終導致腫瘤形成，研究者確定了LATS2是p53信號通路的潛在靶點。在一些LATS2突變的精原細胞瘤中，并不過表達miR-372和miR-373。LATS2蛋白抑制細胞周期蛋白E/CDK2的活性，從而中止細胞周期。最新的研究發現，幾乎所有的精原細胞瘤和大多數胚胎癌都特定的過表達miR-372和miR-373[9]。

在精子發生的過程中，基因表達的時間性和空間性至關重要。精原細胞有周期性的轉錄沉默期，因而使得轉錄后調節顯得很重要[10]。無論是精原細胞瘤還是非精原細胞瘤，都是由早期的病灶發展而來，研究發現原位癌(carcinoma in situ，CIS)源于精原細胞形成精子的功能障礙[11]。在精子的生發過程中，miRNA表達譜的改變與原位癌的發生密切相關，生發期間上調的miRNA有miR-136、miR-743a、miR-463，下調的miRNA有miR290-5p、miR291a-5p、miR-294、miR-293，對以上miRNA的靶點進行分析，提示這些miRNA可能作用于PTEN、CXCR4以及Wnt/β-catenin信號通路，參與睪丸生殖細胞腫瘤的轉移[12]。PTEN是一種腫瘤抑制因子，可以阻斷PI3K信號通路，從而對細胞生長起到負性調節作用。因此PTEN的抑制促進細胞增殖加速，最終導致腫瘤發生。原位癌的侵襲性轉化也涉及PTEN的缺失[13]。此外，作為PIK激酶的負性調節因子，PIK3IP1的缺失與睪丸生殖細胞腫瘤的復發率上升有關[14]。miR-199a的功能取決于其下游靶點。在睪丸生殖細胞腫瘤中，MAFB可能是miR-199a-5p的靶點，并且miR-199a-5p的腫瘤抑制效應是由MAFB調控[15]。

2microRNA的診斷意義

通過多重分析和檢測手段，發現miR-371-3和miR-367對于睪丸癌的診斷有重要意義。在診斷的過程中，可以從患者的血清中分離這些miRNA，并與正常對照做對比。在一項包含病理確診患者和正常對照的研究中，傳統的AFP和hCG檢查的診斷準確率不超過60%，并且對精原細胞瘤的診斷準確率僅有40%，但在結合TsmiR檢測之后，診斷準確率提高到98%[16]。在精原細胞瘤的診斷中，TsmiR檢測相對現有的AFP/hCG檢查的優勢巨大。這個結果在探討其他起源的睪丸癌的研究中得到了進一步確認[17]。然而，對于患者血清中的miRNA水平是否可以預測存在轉移灶，還需要做進一步的研究。此外，miR-371-3和miR-367可用于高危人群的篩查，例如性發育障礙(disorders of sex development，DSD)的患者。另外一項報告顯示，如果血清中可以檢測到過表達的miR-371-373和miR-302，提示患有睪丸生殖細胞腫瘤[18]。Murray等分析8例睪丸生殖細胞瘤后發現，其血清miR-372和miR-367水平在診斷時普遍發生升高，并且血清miR-372和miR-367水平還與腫瘤總體積有關[17]。

最近有一項令人興奮的發現，那就是根據不同的miRNA表達譜，可以區別不同的睪丸癌亞型，例如miR-122a只在卵黃囊瘤中表達。miR-371-373和miR-302a-d簇在精原細胞瘤中上調，但仍低于正常睪丸組織中的水平，可以被用來鑒別畸胎瘤、胚胎細胞癌以及卵巢內胚層竇瘤[19]。

3治療、預測治療反應性與監測

臨床上對睪丸生殖細胞腫瘤的治療與監測，是基于血清生物標志物的檢測之上。然而，僅有不到60%的患者的AFP(a-fetoprotein/甲胎蛋白)、hCG(human chorionic gonadotropin/人絨毛膜促性腺激素)和LDH(lactatec dehydrogenase/乳酸脫氫酶)升高[20]。miRNA在體液內高度穩定，并且有些miRNA在腫瘤組織內大量表達。在一項包括24例睪丸癌患者(20例為Ⅰ期，另外4例為Ⅱ或Ⅲ期)的臨床試驗中，抽取患者在治療前和治療后的血液標本進行分析，顯示所有患者的血清miR-371a-3p、miR-372、miR-373-3p水平明顯高于健康對照(17例)。在Ⅰ期睪丸癌患者中，3種血清miRNA水平在術后顯著降低，低于正常水平。而在Ⅱ或Ⅲ期患者，血清miRNA水平在治療結束后回歸到正常水平[21]。另一項研究，11例患者均為Ⅰ期睪丸癌(6例精原細胞瘤，5例非精原細胞瘤，平均年齡35歲)，對照組為12名健康男性(平均年齡36歲)，檢測患者在睪丸切除術之前和術后5天的血清miRNA水平，術前和術后的miRNA水平比較采用雙側Mann-Whitney U檢驗，結果顯示睪丸癌組術前miR-371-3水平顯著高于對照組，睪丸癌組術后的miR-371、miR-372、miR-373水平分別為術前的1/304、1/24、1/13(P<0.01)[22]。

順鉑是治療睪丸生殖細胞腫瘤的常用化療藥物，然而在化療結束后，順鉑的毒性還會持續很長一段時間，無疑降低了患者的生活質量。癌細胞的miRNA可以影響其對化療的反應性，調節細胞對化療藥物的敏感性。在一項研究中，研究者評估NT2細胞(睪丸生殖細胞腫瘤細胞株NTERA-2)[23]的miR-302a對順鉑細胞毒性的影響。在順鉑處理的NT2細胞，miR-302a出現了升高。miR-302a的下調可以增加NT2細胞對順鉑的敏感性，因為miR-302a的下調促進順鉑誘導的G2/M期阻滯，從而加速細胞凋亡。miR-302a還通過降低凋亡臨界值而提高順鉑的殺傷效果。并且，這種效應在另外一種睪丸生殖細胞腫瘤細胞株NCCIT中也可以見到。此外，miR-302a還可以下調NT2細胞中p21的表達，從而提高細胞對順鉑的敏感性。miR-302a介導的細胞凋亡，還可以通過p53沉默而得到進一步加強。因此，miR-302a可以為睪丸生殖細胞腫瘤的治療干預提供一個新選擇[24]。另一個研究通過上調miR-383、抑制蛋白磷酸酶1和調節亞基10(PNUTS)的表達，顯著增強順鉑對NT2細胞造成的DNA損傷，這可能是因為miR-383影響H2AX基因的磷酸化[25]。通過轉染miR-372和miR-373到人類原生細胞，可以抑制致癌基因Rasv12調控的細胞增殖，可用來開辟新的治療方法。

4預后及隨訪

評判生育能力的常用方法是精子質量分析和檢測血清激素水平，但這些手段的評價尺度不一，并且對睪丸的某些微小但意義重大的變化不敏感[26]。在動物模型中敏感性很高的組織病理學檢查方法，目前受限于各方面的條件而不能用于臨床[27]。因此，亟需發掘對睪丸損傷敏感的生物標志物，以監測生育功能，尤其是在進行生殖腺毒性化療之后。成熟的精子含有miRNA，異常的miRNA與少精癥和無精癥有關，提示miRNA對于精子發揮正常功能很重要[28]。有學者認為，精子遞送到卵子的miRNA在正常的胚胎發育中能發揮作用[29]。

對睪丸癌患者其睪丸切除術之前和之后的miRNA水平進行分析，提示miRNA可能具有預測預后價值。相比正常對照，所有睪丸切除術之后的血清標本中的miRNA水平沒有差異。目前，有研究正在探索TsmiR在隨訪中的作用。無論是在成人或是兒童睪丸癌患者，TsmiR都有望成為隨訪的重要工具[30]。

綜上所述，近年來隨著對miRNA研究的不斷深入，miRNA在睪丸腫瘤的診斷、治療及檢測中，可以同時具有高特異性和高敏感性，并易于檢測。雖然目前的研究表明miRNA有美好的前景，但無疑還需要經過大量的研究才能證實。

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(編輯：甘艷)

(收稿日期2015-04-20修回日期 2015-08-24)

文章編號：1001-5930(2016)04-0694-03

中圖分類號：R737.21

文獻標識碼：B

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.04.056

通訊作者：錢輝軍