SELEX技術及其在植物檢疫中的應用前景

李建勇，王英超，王　飛，紀　瑛，厲　艷，吳興海，王　簡，邵秀玲.濟南出入境檢驗檢疫局，山東濟南5004.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島6600

?

SELEX技術及其在植物檢疫中的應用前景

李建勇1，王英超2，王飛1，紀瑛2，厲艷2，吳興海2，王簡2，邵秀玲2
1.濟南出入境檢驗檢疫局，山東濟南250014
2.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島266002

摘要：SELEX是從人工體外合成的隨機單鏈核酸序列庫中篩選出特異性與靶物質高度親和的適配體的篩選技術。該技術的基本途徑主要是通過人工合成的隨機寡核苷酸序列文庫，歷經篩選、分離、富集得到能與各種配體結合的寡核苷酸適配體，具有高特異性、高親和力和穩定性良好的特點。本文綜述了SELEX技術的發展，介紹了目前的研究進展，以及該技術在植物檢疫領域中的應用情況，并對其前景進行分析和展望。

關鍵詞：SELEX技術；植物檢驗檢疫；應用

美國的Gold和Ellington首先提出并命名了指數富集配體系統進化（Systematic evolution of ligan ds by exponential enrichment，SELEX），該技術主要是從人工體外合成的隨機單鏈核酸序列庫中篩選出特異性與靶物質高度親和的適配體（Aptamer）的篩選技術[1]。該技術的基本途徑主要是通過人工合成的隨機寡核苷酸序列文庫，歷經篩選、分離、富集得到能與各種配體結合的寡核苷酸適配體，而這種適配體具有高特異性、高親和力和穩定性良好的特點。目前SELEX技術篩選的靶分子不僅包括無機離子、小分子有機化學物、核酸、蛋白質等，甚至擴展到了完整的細胞、病毒、細菌病原體等復雜靶分子[2-5]。本文主要介紹SELEX技術在微生物鑒定方面的應用及在植物檢疫中的應用前景。

1　SELEX技術的發展

隨著SELEX技術研究的深入，近年來在傳統SELEX技術基礎上不斷發展和完善各類衍生SEL EX技術，如導向SELEX技術（Blended SELEX）、基因組SELEX（Genomic SELEX）、復合靶分子SELEX（Complex targets SELEX）、細胞消減SELEX技術（Subtractive SELEX）等，這些技術在生命科學基礎研究、藥物篩選、食品安全分析等領域顯示出廣闊的應用前景。其中，導向SEL EX技術是將能特定的與需要研究的物質如蛋白質結合的小分子制備成一個寡核苷酸文庫，這樣借助SELEX篩選出的寡核苷酸適配體只與蛋白上的特異表位高度專一的結合，避免了它與細胞內一些未知成分結合，從而增加了篩選的特異性。基因組SELEX，是從生物體的基因組寡核苷酸文庫中篩選蛋白質、多糖等生活活性物質的靶序列，通過篩選的天然識別序列，可以更快更好地發現新的蛋白結合位點、蛋白質合成以及研究蛋白與核酸間的相互作用、復雜調控元件等[6]。

復合靶分子SELEX技術以多種分子構成混合靶標，可同時篩選出多種靶分子的適配子而不互相干擾。但這種有關復合靶子SELEX的研究均建立在已知的靶分子基礎上[7-9]。細胞消減SELEX（Subtractive SELEX）的技術優勢主要是在目標靶分子未知的條件下，使用與目標細胞近似或同源性的和細胞寡核苷酸文庫進行消減篩選，從而去除文庫中的均能夠識別目標細胞和同源細胞的適配體，最終獲得能特異識別目標細胞（靶細胞）的寡核苷適配體[10]。2009年李慧[11]等，在目標細胞（已分化PC12細胞）與對照細胞（未分化PC12細胞）之間分子差異未知的條件下，首次成功地應用消減細胞SELEX技術篩選到了能特異識別目標細胞而不識別對照細胞的單鏈DNA（ssDNA）適配體，從而將SELEX技術篩選的靶分子擴展到了完整細胞等復雜分子。以上幾種衍生SELEX技術在微生物鑒定方面也得到了較好的應用。

2　SELEX技術在微生物鑒定方面的應用

近年來，SELEX技術越來越受到人們的重視。目前，國內外已有利用SELEX技術在生命科學研究、生物醫藥、食品安全檢測中應用的相關報道。在微生物鑒定方面，如醫學疫病診斷、食品微生物檢測也有相關的研究和報道。

2.1在醫學疫病診斷中的應用

通過SELEX技術篩選得到的適配體與靶物質結合具有高特異性、高親和力和良好穩定性的特點，這種特點可以在微生物鑒定包括醫學疾病診斷中得到具體廣泛的應用。在醫學領域，目前應用核酸適配體檢測靶蛋白的研究比較多，但成熟的臨床應用報道還比較少。

Horii等[12]通過SELEX技術篩選針對神經鞘氨醇磷酸膽堿（Sphingosyl phosphoryl choline，SP C）的特異性RNA適配體，該適配體與分磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1-phosphate，S1P）無交叉反應，應用這種篩選技術可以較好的研究SPC的生物學功能及臨床診斷。在流感病毒的分型診斷研究中，Go pinath等[13]通過SELEX技術篩選與B型流感病毒血球凝集素蛋白無交叉反應的適配體，通過該適配體的研究為該病毒的分型診斷提供了堅實的基礎。詹林盛等[14]以重組的丙型肝炎病毒（Hepatitis C v irus，HCV）C蛋白為靶蛋白，從人工體外合成的隨機單鏈核酸序列庫中篩選出特異性與靶物質高度親和的核酸適配體，為有效研究丙型肝炎病毒C蛋白抗原檢測和以C蛋白為靶位的抗HCV治療提供了有價值的工具。李衛濱等[15]運用SELEX技術從合成的隨機單鏈核酸序列庫中篩選到針對全血環孢素A的特異性適配體，該方法采用生物素鏈親和素磁珠分離法制備次級文庫，為全血環孢素A濃度的快速而簡便的實驗室診斷提供了新的思路和方法。王立峰等[16]通過SELEX技術，通過7輪篩選獲得癌胚抗原（Carcino-embryonic antigen，CEA）的特異性適配體，該適配體與純化的癌胚抗原和天然狀態的癌胚抗原蛋白都有很好的特異性，為建立癌胚抗原腫瘤的靶向診斷和治療奠定了基礎。甘龍杰等[17]通過SELEX技術篩選出了對金黃色葡萄球菌外毒素B（Staphylococcal enterotox in B，SEB）特異性的適配體（A11），通過對臨床6例患者血清標本的檢測，表明該適配體特異性強，能夠簡便、快速、靈敏的識別SEB患者血清，具有很好的應用前景。

2.2在食品微生物檢測中的應用

在食品微生物檢測方面，SELEX技術與其他技術相結合在微生物鑒定方面應用較為廣泛。

Joshi等[18]通過SELEX技術篩選獲得了針對腸道血清型沙門氏菌的特異性適配體，將該適配體與磁珠連接，能夠在沙門氏菌病原水平較低的情況下抓捕并檢測到該菌，檢測下限為10-102CFU/mL，為食品和環境樣品中沙門氏菌的檢測提供了新的思路和方法。Hye等[19]將從大腸桿菌中篩選的核酸適配體與RT-PCR技術相結合，建立了檢測大腸桿菌的方法，該方法線性范圍為10-107CFU/ mL，檢測下限為10 E.coli /mL。Edith和Alociljac[20]對適配體生物傳感器在微生物檢測中的應用做了較為全面的回顧及展望。Ohk[21]等應用核酸適配體與抗體功能化的光導纖維生物傳感器對人工污染的牛肉、雞肉等食品中的李斯特菌進行了特異性檢測，檢測下限為103CFU/mL。國內研究方面，曹曉曉等[22]通過細菌消減SELEX技術，以完整的金葡菌細菌為目標靶，使用與金葡菌細菌近似或同源性的鏈球菌和表皮葡萄球菌為消減靶，和寡核苷酸文庫進行消減篩選，最終獲得一組能特異識別金葡菌的寡核苷適配體，結合流式細胞儀和共聚焦顯微鏡檢測，能夠將金葡菌和消減靶細菌及大腸桿菌進行有效的區分，大大提高了對各型金葡菌的檢出率。

3　SELEX技術在植物檢疫工作的應用前景

3.1口岸植物檢疫存在的難題

植物檢驗檢疫從常規的分離技術如分離、純化、培養、鑒定逐步發展到免疫學方法、分子生物學方法。分子生物學檢測從普通的PCR技術、巢式PCR到目前先進的LAMP、實時熒光PCR、基因芯片等檢測技術，檢測的靈敏度有了很大的提高，能夠滿足檢疫部門日常檢測的需要，使外來有害生物傳入的風險大大降低。但在實際口岸檢疫中，由于研究資料的缺乏和技術的限制，常常面臨以下幾個難題：

首先，現有的植物病原細菌分子檢測技術，無論是常規PCR，還是實時熒光PCR、基因芯片等都是以16 SrDNA作為細菌群落結構分析最常用的系統進化標記，分子標記單一。而細菌中其他基因的序列大部分未知，無從設計引物。急需通過新的技術發現病原細菌特異性寡核苷酸或蛋白序列，為分子檢測奠定基礎。

其次，變種分型難。新修訂并公布的《進境植物檢疫危險性病蟲雜草名錄》中有的植物病原細菌特別是致病變種，在現有技術和研究資料下，還不能有效區分，給口岸檢疫鑒定帶來一定的困難。

再次，富集困難。進口種子中種傳病原細菌含量低，常規的病原富集技術難以實施，造成許多微量病原菌的漏檢。而目前的分子檢測技術都是以分離到病原菌并提取到目標病原菌的DNA為前提的，因此在病原菌含量低的情況下分子檢測技術也無能為力。急需研究有效的病原細菌富集技術。

3.2SELEX技術在植物檢疫工作上的優勢及應用前景

目前國內外還沒有SELEX技術在植物檢疫上應用的報道。在口岸檢疫中，為了解決植物病原細菌分子檢測采用分子進化標記單一；種傳病害中致病菌的含量低而難以施檢；有些病原細菌的致病變種不能很好的區分；很多致病性細菌基因水平研究不夠深入，并且病原細菌在不同狀態下很容易發生變異，致使很多疾病在其發病早期無法檢測到或是被漏檢等問題，我們可以通過構建以完整細胞為靶子的SELEX技術，把病原細菌看做是一個含有多種成分的復合物，以整個細菌作為靶分子進行篩選，就可以在未知細菌的內部結構、功能的情況下篩選出與其特異性結合的一組適配體，這組特異性的適配體與單個適配體相比，能提高細菌檢出的敏感性和特異性。同時，適配體與靶物質的結合方式同抗原-抗體反應相似，具有高度識別并特異性結合靶物質的能力。若與磁珠偶聯結合使用，可以作為病原富集的捕捉分子，大大提高對微量病原菌的富集能力。可以看出，SELEX技術有優勢可以解決目前植物檢疫工作中的面臨的諸多難題。

因此在植物檢疫領域，我們可以建立基于SELEX技術的植物病原細菌特異性寡核苷酸適配體的篩選，通過篩選到的寡核苷酸適配體，結合富集技術、表面等離子共振（Surface plasmon resonanc e，SPR）技術、表面增強拉曼光譜（Surface enhanced raman spectroscopy，SERS）技術、微流控技術、量子點等技術中的一種或幾種進行致病菌快速、高通量檢測，并形成體系。不僅為植物病原細菌致病變種和植原體病害的快速檢測方法建立奠定基礎，實現植物病原菌快速檢測的整套解決方案，而且在植物檢疫領域應用SELEX技術，必將開拓一個集綜合材料學、生物學、信息學和分子生物學等多學科在內的前沿技術領域，為口岸檢測技術的飛躍打下堅實的基礎。

4　展望

目前，應用SELEX技術篩選適配體在生物醫學、食品檢測等多個領域得到了證明，但是能夠大規模應用還為時尚早。這其中重要的原因主要有，篩選的合適的適配體數目相對較少；適配體的篩選過程較為煩瑣，過程中對適配體的修飾等方案還需優化，這影響了適配體的穩定性和特異性；由于體內環境的復雜性，實驗室篩選的適配體在實際應用中可能效果不理想。當然隨著科學技術的進步特別是SELEX技術的不斷完善和發展，種種問題終將解決，SELEX技術必將在各個領域，當然也包括植物檢疫領域中得到廣泛的應用。

參考文獻

[1] Ulrich H，Martins AH，Pesquero JB. RNA and DNA aptamers in cytomics analysis[J]. Cytometry，2004，59A（2）:220-231

[2] Konopka K，Lee NS，Rossi J，et al. Rev－binding aptamer and CMV promoter a decoys to inhibit HIV replication[J]. Gene，2000，255（2）:235-244

[3] Gal SW，Amontov S，Urvil PT，et al. Selection of a RNA aptamer that binds to human activated protein C and inhibits its protease function[J]. Eur J Biochem，1998，252（3）:553-562

[4] Herr JK，Smith JE，Medley CD，et al. Aptamer－conjugated nanoparticles for selective collection and detection of cancer cells[J]. Anal Chem，2006，78:2918-2924

[5] Tang Z，Shangguan D，Wang K，et al. Selection of aptamers for molecular recognition and characterization of cancer cells [J]. Anal Chem，2007，79:4900-4907

[6] Pan W，Xin P，Clawson GA. Minimal primer and primer-free SELEX protocols for selection of aptamers from random DNA libraries[J]. Antimicrob Agents Chemother，2008，52（6）:2097-110

[7] Morris KN，Jensen KB，Julin CM，et al. High afinity ligands from in vitro selection: complex targets [J]. Proc Natl Acad Sci USA，1998（95）:2902-2907

[8] Blank M，Weinschenk T，Priemer M，et al. Systematic evolution of a DNA aptamer binding to rat brain tumor microvessels selectivetargeting of endothelial regulatory protein pigpen [J]. J Biol Chem，2001，276（19）:16464-16468

[9] Hick BJ，Marion C，Chang YF，et al. Tenascin－C aptamers are genetated using tumer cells and purified protein [J]. J Biol Chem，2001，276（52）:48644-48654

[10] Wang C，Zhang M，Yang G，et al. Single－stranded DNA aptamers that bind differentiated but not parental cells:subtractive systematic evolution of ligands by exponential enrichment [J]. Biotechnology，2003，102:15-22

[11] Li H，Xu H，Ding HM，et al. Identification of an aptamer targeting hnRNPA1 by tissue slide－based SELEX [J]. Pathology，2009，218:327-336

[12] Ho riiK，OmiK，Yo shida Y，et al. Development of a sphingo sylpho spho ry lcho line detection system using RNA aptamers. Molecules[ J]. 2010，15（8）:5742-5755

[13] Gopinath SC，Kawasaki K，Kumar PK. Selection o f RNA-aptamer against human influenza B virus[ J]. Nucleic Acids Symp Ser（Ox f），2005（49）:85- 86

[14]詹林盛，孫紅琰，彭劍淳，等.丙型肝炎病毒核心蛋白寡核苷酸適配子的篩選與鑒定[J].中華微生物學和免疫學雜志，2002，22（5）:578-581

[15]李衛濱，蘭小鵬，楊湘越，等.SELEX技術在篩選環孢霉素A適體中的運用[J].福州總醫院學報，2007，14（3）:171-173

[16]王立峰，魏嘉，殷海濤，等.癌胚抗原特異性寡核苷酸適配子的體外篩選及其意義[J].醫學研究生學報，2007，20（9）:903-907

[17]甘龍杰，蘭小鵬，江麗，等.金黃色葡萄球菌外毒素B特異性適體的篩選及其應用[J].生物技術通訊，2010，21（2）:232-235

[18] Joshi R，Janagama H，Dwivedi H P，et al. Selection, characterization，and application of DNA aptamers for the capture and detection o f Salmonellaen terica sero vars[J]. Mol Cell Probes，2009，23（1）:20-28

[19] Hye JL，Byoung CK，Kyung WK，et al. A sensitive method to detect Escherichia coli based on immunomagnetic separation and real-time PCR amplification of aptamers[J]. Biosensors and Bioelectronics，2009，24（12）:3550-3555

[20] Edith TC，Alocilja EC. Aptasensors for detection of microbial and viral pathogens[J]. Biosensors and Bioelectronics，2009，24（11）:3175-3182

[21] Ohk S，Koo O，Sen T，et al. Antibody-aptamer functionalized fibre-optic biosensor for specific detection of Listeria monocytogenes from food[J]. Journal of Applied Microbiology，2010，109（3）:808-817

[22] Cao X，Li S，Chen L，et al. Combining use of a panel of ssDNA aptamers in the detection of Staphylococcus aureus. Nucleic Acids Res，2009，37（14）:4621-4628

Application Prospects of SELEX Technology in Plant Quarantine

LI Jian-yong1，WANG Ying-chao2，WANG Fei1，JI Ying2，LI Yan2，WU Xing-hai2，WANGJian2，SHAOXiu-ling2
1. Jinan Entry-Exit Inspection and Quarantine, Jinan 250014，China
2. Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine, Qingdao 266002，China

Abstract:SELEX is a new combinatorial technique screening the oligonucleotide sequence which is specific combined with various target molecules in vitro. The selectivity，affinity and stability of SELEX are high. The specific adapters can be found in the synthetic oligonucleotide library by screening，separation and enrichment. The article reviewed the progress and application of the SELEX in plant quarantine and analyzed its prospect and an outlook.

Keywords:SELEX；plant quarantine；application

作者簡介：李建勇（1970-），男，博士，高級農藝師.主要從事植物檢疫工作. E-mail:lijianyong1996@sohu.com

基金項目：國家質檢總局科技計劃項目（2015IK213、2013IK293）；山東檢驗檢疫局科技計劃項目（SK201437）；山東省科技攻關項目（2011GGB0003）

收稿日期：2015-11-11修回日期：2015-12-16

中圖法分類號：Q789

文獻標識碼：A

文章編號：1000-2324（2016）01-0060-04