豬細小病毒分子生物學診斷技術及基因工程疫苗的研究進展

李天芝，于新友，謝金文，沈志強

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東濱州256600）

豬細小病毒分子生物學診斷技術及基因工程疫苗的研究進展

李天芝1，于新友1，謝金文2，沈志強2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東濱州256600）

文章論述了豬細小病毒分子生物學診斷方法，包括常規PCR方法、多重PCR方法、熒光定量PCR方法、環介導等溫擴增技術、基因芯片等，并就其基因工程疫苗方面的研究進行了著重闡述。

豬細小病毒；分子生物學診斷；基因工程疫苗

豬細小病毒（porcine parvovirus,PPV）可引起母豬發生流產、產死胎、產畸形胎、胎兒木乃伊化和不孕等，初產母豬受到的危害最為嚴重[1]。PPV為細小病毒科細小病毒屬成員，只有一個血清型，為單股線狀負鏈DNA病毒，基因組大小約為5 000 bp，共編碼3種結構蛋白VP1、VP2、VP3和3種非結構蛋白NS1、NS2、NS3。1966年Mary和Mahnel首次發現該病毒，后來證實了其致病作用[2]，PPV在世界各地廣泛流行[3]，1983年，我國首次發現該病，隨后在四川、浙江、吉林和上海等地均有相關報道[4]。一旦PPV傳入陰性豬場，可在3個月內感染豬場所有豬，在本病發生后，豬場可能連續幾年不斷地出現母豬繁殖失敗[5]。PPV常和豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）、乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）、豬圓環病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）等混合感染而加重了其危害，給世界養豬業帶來巨大的經濟損失[6]。近年來，各國專家學者對PPV分子生物學診斷技術及基因工程疫苗進行了大量的研究，本文就研究進展情況綜述如下。

1 分子生物學診斷

1.1 常規PCR方法

PCR方法是根據目的片段序列設計引物，借助儀器和DNA聚合酶體外大量擴增部分或全部目的片段，是一種快速、簡便、特異的診斷方法。劉業兵等[7]建立了PPV PCR檢測方法，可成功擴增出1 980 bp預期片段，該法特異性好，對其他豬病毒的檢測結果均為陰性，敏感性強，可檢測到0.9 TCID50、0.001個HA的病毒。崔宇超等[8]根據PPV VP2基因的保守區域設計1對擴增472 bp片段的特異性引物，建立了PPV納米PCR檢測方法，該法檢測敏感性是普通PCR的1 000倍，最低核酸檢出量為4拷貝/μL。對其他相關病毒核酸檢測結果均呈陰性。分別采用納米PCR和普通PCR對3個省份送檢的43份臨床樣品進行檢測，PPV陽性率分別為95%（41/43）和75.6%（31/41），表明該納米PCR檢測方法具有更高的敏感性，適用于PPV低含量臨床樣品的檢測。

1.2 多重PCR方法

多重PCR是一種特殊的PCR技術，它在同一PCR體系中，加入多對引物，同時檢測2種或2種以上的病毒DNA，它具有快速、靈敏度高、高效、特異性強等優點而廣泛用于臨床的快速診斷。岳豐雄等[9]建立了一種能夠同時檢測PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR方法，分別可擴增PCV2 ORF2基因353 bp片段、PPV NS1基因271 bp片段、PRRSV MN基因美洲型434 bp片段、PRV gB基因194 bp片段。該方法具有很好的特異性，對豬瘟病毒、大腸桿菌和雙蒸水的PCR擴增結果均為陰性，敏感性高，對PPV、PRV、PRRSV和PCV2的最低檢測量分別為8.64×10-3、2.36×10-3、3.68×10-3、2.90×10-4μg。朱向博等[10]根據GenBank中PPV VP2基因和豬源腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）3D基因，采用Primer Premier 5.0軟件設計出PPV和EMCV的特異性引物。通過優化反應條件，建立了能同時特異性檢測PPV和EMCV的二重PCR方法，PPV和EMCV的敏感性檢測極限分別達7.62和1.22× 10-1pg/μL。謝燕婷等[11]利用DNAstar軟件對PRV gB基因、PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因的保守區設計引物，對PRV、PCV2和PPV擴增片段的大小分別為373、430和495 bp，對PRV、PCV2和PPV核酸檢測的敏感性分別為1.62×10-6、1.47×10-6和1.28×10-4ng，對滅菌雙蒸水、豬繁殖與呼吸綜合征病毒cDNA和豬瘟病毒cDNA的mPCR擴增結果均為陰性。于新友等[12]根據GenBank中登錄的PCV2和PPV核苷酸序列，分別設計2對引物，在建立各病毒單項PCR技術的基礎上，優化雙重PCR反應條件，建立了2種病毒的雙重PCR檢測方法，用這2對引物對同一樣品中的PCV2和PPV核酸模板進行雙重PCR擴增，結果可同時擴增PCV2的245 bp、PPV的475 bp的特異性片段，而對其他4種病原的PCR擴增結果均為陰性。敏感性測定結果表明，該雙重PCR技術能檢出1 pg的PCV2和1 pg的PPV模板。

1.3 熒光定量PCR方法

熒光定量PCR技術是指采用SYBR GreenⅠ熒光染料或熒光探針通過連續監測熒光信號強弱的變化來測定特異性產物的量，不需要分離PCR產物，即能準確定量起始模板數。黃律等[13]根據Gen－Bank中發表的PPV4型全基因組序列，針對其結構蛋白VP2基因的保守序列，設計1對引物，建立了PPV4的Taq Man熒光定量PCR。該法在6.73×109copies/μL至6.73×101copies/μL范圍內線性關系良好，相關系數為0.998，對PPV4的最低檢測限為6.73×101copies/μL。特異性試驗結果顯示，用該方法檢測其他基因型PPV、PRRSV、豬瘟病毒及PCV2等臨床常見病毒，結果均為陰性，批內及批間變異系數均低于2%。沈志強等[14]根據GenBank登錄的PPV VP2基因序列設計1對引物，建立了檢測PPV的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法，結果顯示，標準曲線循環閾值與模板濃度呈良好的線性關系，R2=0.997 6，產物Tm為82.3～82.9℃，檢測靈敏度為72.1拷貝/μL，特異性和重復性良好。容新宗等[15]根據PPV的VP2基因保守序列，設計并合成引物，對目的片段進行PCR擴增，將擴增的PPV VP2基因片段克隆入PMD19-T載體，重組質粒PMD19-T-VP2經測序鑒定正確后，作為標準品模板，建立了以EvaGreen為染料的實時熒光定量PCR檢測PPV的方法，結果顯示，用重組質粒PMD19-T-VP2制作的熒光定量PCR擴增曲線循環閾值與模板濃度具有良好的線性關系，該方法檢測靈敏度的下限能達到102copies/μL，與其他DNA病毒和同種屬的細小病毒無明顯的交叉反應，連續重復檢測高、中、低濃度樣品，批內批間變異系數小，重復性好。鄭蘭蘭等[16]根據GenBank中登錄的基因序列，分別設計了2對針對PRV gH和PPV NS1基因的引物，建立一種能快速、靈敏、同時檢測出PPV與PRV的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法。結果顯示，PPV與PRV熒光定量PCR的標準曲線的Tm值分別為80.9℃和86.5℃，熔解曲線特異，靈敏度分別可達248拷貝/μL和160拷貝/μL，是普通PCR檢測方法的100倍。余波等[17]根據GenBank中PPV VP2基因序列設計特異性的引物，PCR擴增獲得PPV VP2基因片段，并克隆到pMD-18T載體上作為陽性標準品。通過對SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應條件的優化，建立了PPV的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR診斷方法，以此為基礎研制出試劑盒。試劑盒擴增產物的熔解曲線分析只出現1個單特異峰，無引物二聚體，對PRV、PCV2、E.coli、豬瘟病毒、PRRSV均無陽性信號擴增，可重復性好，測靈敏度可達1.0×101拷貝/μL。

1.4 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplication,LAMP）是在等溫條件進行擴增反應。基因的擴增和產物的檢測可一步完成，擴增效率和特異性高，可在15～60 min擴增109～1010倍，可只通過擴增產物的有無來判別。劉業兵等[18]據GenBank公布的PPV序列，在其保守序列區域設計了多套LAMP引物，建立了對PPV LAMP檢測方法，結果顯示，該法在63℃恒溫下作用45 min，PPV DNA獲得了高效率的特異性擴增，其檢出限量為0.23 TCID50，敏感性高，在反應結束后加入SYBR GreenⅠ肉眼判斷結果，與Real Time Turbidimeter LA-320儀監測結果一致。黃書林等[19]針對PPV NS1基因保守區域設計6條特異引物，建立了一種靈敏、特異、快速的PPV LAMP檢測方法，該法在63℃的等溫條件下45 min即可完成反應。最低檢測限量為10拷貝的PPV目的基因，比常規PCR法敏感100倍，具有良好的特異性。以鈣黃綠素和Mn2+作為熒光指示劑，可快速、直觀判定反應結果。陳星瑤等[20]建立了快速檢測PPV的LAMP方法，通過優化反應條件，擴增溫度60℃、62℃、64℃和66℃均可以，最佳擴增時間為45 min，最低可檢測10拷貝的PPV核酸模板量，特異性良好，對豬鏈球菌、PRRSV、豬水皰病病毒、PRV、豬瘟病毒、豬流感病毒、O型口蹄疫病毒、豬藍耳病病毒和水擴增結果均為陰性，不需要電泳檢測反應結果，只需向產物管內加SYBR GreenⅠ熒光染料，肉眼觀察，陽性反應管顏色立刻變為黃綠色，且模板濃度不同顏色有深淺變化，結果容易判定，適于臨床推廣。

2 基因工程疫苗

2.1 核酸疫苗

構建含有外源抗原基因的重組質粒，免疫動物后，表達的特異性抗原蛋白通過與MHC-Ⅰ類或MHC-Ⅱ類抗原分子結合，刺激機體產生特異性免疫應答，該類疫苗稱為核酸疫苗，又名DNA疫苗。王印等[21]構建了含有PPV VP2基因核酸疫苗pcDNAVP2，肌注BALB/c小鼠，作間接ELISA抗體檢測試驗，并采用淋巴細胞增殖試驗（MTT法）和流式細胞儀（FACS）法對小鼠的細胞免疫進行檢測。結果表明，pcDNA-VP2能誘導小鼠產生細胞免疫和體液免疫應答。梅淼等[22]構建了重組質粒pCI-IFN-γ.ORF2. VP2和pCI-ORF2.VP2，分別將重組質粒肌肉注射免疫小鼠，并設pCI-neo、PBS、PPV滅活苗和豬圓環病毒亞單位疫苗免疫組做對照，檢測小鼠不同時期的淋巴細胞轉化功能、T淋巴細胞亞群動態變化情況以及PPV、PCV2抗體水平。結果顯示，pCI-IFN-γ. ORF2.VP2免疫組從第7天開始脾淋巴細胞對ConA有明顯反應，顯著高于對照組和pCI-ORF2.VP2免疫組，CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞的數量高于或顯著高于對照組和pCI-ORF2.VP2免疫組，在免疫后第14天檢測到PPV、PCV抗體。說明pCI-IFN-γ. ORF2.VP2能夠有效誘導機體產生細胞免疫和體液免疫。孫彥欣等[23]將PCV2編碼T細胞表位P21多肽的序列連接于PPV VP2基因的5'端克隆于pcDNA3.1（+）中，構建重組表達質粒pcDNA-P21-VP2，將其肌肉注射BALB/c小鼠后，檢測免疫相關指標，結果顯示，重組質粒能夠有效誘導小鼠產生明顯的抗體反應，并且對淋巴細胞的增殖反應有明顯促進作用。

2.2 活載體疫苗

采用弱毒或無毒病原微生物作為表達載體，對其導入外源抗原基因，制成疫苗后，接種動物，誘導機休產生特異性免疫應答反應，這類新型疫苗稱為活載體疫苗。徐義剛等[24]將構建的重組PPV VP2基因的細胞表面表達型載體pPG-VP2電轉化干酪乳桿菌L.casei393，獲得陽性重組菌pPG-VP2/L.casei393。將重組菌及空質粒菌株分別口服接種BALB/c小鼠，收集糞便及腸黏液樣品測定小鼠產生抗VP2的特異性sIgA，采集血液樣品測定小鼠產生抗VP2的特異性IgG，并對獲得的抗體進行PPV中和活性的測定。結果顯示，該重組菌能誘導小鼠產生高水平的抗PPV sIgA和IgG抗體水平，其對PPV的中和效價分別為1∶24和1∶128。王林青等[25]將PPV VP2基因和豬IL-18基因分別插入到PRV轉移質粒PG中，得到重組質粒PG18-VP2。利用脂質體轉染法將重組轉移質粒PG18-VP2與豬PRV弱毒株DNA共轉染豬睪丸細胞，以EGFP熒光標記，通過5輪蝕斑篩選純化，成功獲得表達PPV VP2蛋白和豬IL-18且帶EGFP標記的重組偽狂犬病病毒IL18-VP2-rPRV。用重組病毒感染ST細胞，12 h后在熒光顯微鏡下可見明亮的綠色熒光，通過RT-PCR證實感染細胞中含有PPV VP2和豬IL-18 mRNA，Western-blot試驗結果顯示，重組病毒能表達具有生物活性的PPV VP2蛋白和豬IL-18。重組病毒經連續20次傳代后感染細胞仍能發出綠色熒光，PCR檢測表明VP2及IL-18基因在重組病毒中能穩定遺傳。為進一步研究表達PPV VP2蛋白和豬IL-18的重組豬偽狂犬病病毒的免疫效力奠定了基礎。

2.3 病毒樣顆粒疫苗

病毒樣顆粒又稱偽病毒或假病毒，是由病毒的一個或多個結構蛋白自動組裝而成的空心顆粒，外形與天然病毒粒子相似，不含病毒核酸，不能復制，具有很強的免疫原性，可作為免疫源，安全性好，無感染性，能誘導機體的免疫系統產生免疫保護反應，是研制安全高效的預防病毒病的潛在候選疫苗。Martínez等[26]將PPV VP2基因克隆到桿狀病毒系統中，并成功地在昆蟲細胞中高效表達，表明VP2多肽能夠自我裝配成VLPs，該研究為PPV新型亞單位疫苗的研究提供了新思路，而且PPV VLPs不僅自身可以作為疫苗，在外源多肽的轉運及多價疫苗的研制中也發揮重要作用。Antonis等[27]用昆蟲細胞中表達的PPV VP2基因產物制備VLPs疫苗，在添加免疫佐劑的情況下，VLPs疫苗可在豬體內產生高滴度的血清抗體。潘群興等[28]將O型口蹄疫病毒（FMDV）VP1中編碼T細胞表位肽（aa 21-aa 40）序列連接于PPV VP2的5'端，并插入到桿狀病毒供體質粒pFastBac HTA中，構建成重組轉座載體pFastBac-FMDV-VP1-PPV-VP2，轉化含有穿梭載體Bacmid的E.coli DH10Bac中，經藍白菌落篩選獲得重組桿狀病毒表達質粒rBac-FMDV-VP1-PPVVP2，轉染昆蟲草地夜蛾（Sf9）細胞，并在Sf9中進行了表達。電鏡觀察顯示，表達的重組蛋白能夠自我組裝成病毒樣顆粒，小鼠免疫試驗證實，在低濃度FMDV抗原下能夠產生特異性T淋巴細胞增殖反應，而且該病毒樣顆粒能誘導機體產生抗FMDV特異性細胞免疫反應。徐志文等[29]以pEGFP-C1為載體構建了含有PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因的重組質粒pEGFP-VP2.ORF2，經轉染及電鏡觀察表明成功獲得VP2.ORF2重組病毒樣顆粒。重組病毒樣顆粒經超速離心純化后免疫小鼠，同時設立PPV普通疫苗組、PCV2弱毒株組及空白對照組，并在不同時期檢測小鼠CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞動態變化情況及PPV和PCV2抗體水平。結果顯示：VP2. ORF2重組病毒樣顆粒免疫小鼠后能誘導較高水平的細胞免疫和高于同等條件普通疫苗和弱毒株的體液免疫水平。陳楊等[30]利用PCR技術從PPV SC1株基因組中擴增VP2全基因，并將其插入真核表達載體pPI-2.EG-FP中，構建轉移載體pPI-2.EGFP. VP2。采用脂質體介導法將PRV SA215株DNA與pPI-2.EGFP.VP2 DNA共轉染Vero細胞，待出現細胞病變后收集病毒液。經空斑純化，并同時采用檢測PPV VP2基因的PCR方法篩選獲得重組病毒PRV SA215/VP2株。以兔抗VP2的多克隆抗體建立的免疫熒光技術可檢測到Vero細胞發出的特異性熒光，表明PPV VP2成功插入到PRV SA215基因組中，并獲得表達。進一步電鏡觀察表明，感染PRVSA215/VP2的Vero細胞中可同時觀察到PRV與PPV 2種病毒樣顆粒。結果表明，成功實現了利用PRV載體表達PPV VP2蛋白病毒樣顆粒，為進一步研制PPV病毒樣顆粒疫苗奠定了基礎。

3 小結

PPV是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一，廣泛存在于世界各養豬場，造成的經濟損失十分嚴重，因此，做好豬細小病毒病防控的研究相關工作非常重要。目前已經建立了PPV多種分子生物檢測方法，如常規PCR方法、多重PCR方法、熒光定量PCR方法、環介導等溫擴增技術、基因芯片等，但這些方法各有利弊，有時需將幾種檢測方法結合起來，綜合判斷，才能得到準確的檢測結果。當前對豬細小病毒病的防控主要靠接種疫苗，傳統的滅活疫苗存在需要量大，作用時間短，需多次注射等缺點，弱毒株不易于儲存和運輸，且存在毒力返強的危險。近年來，PPV新型疫苗研制已取得了很大的進展，研制了一系列新型疫苗，如核酸疫苗、活載體疫苗，但核酸疫苗可能與宿主基因發生整介誘發癌變等，活病毒載體疫苗制備技術復雜，主要停留實驗室階段，并沒有大規模推廣應用實際生產中，病毒樣顆粒疫苗具有高效的免疫原性，而且不存在散毒和基因重組的威脅，給PPV的免疫防控帶來了新的希望，成為各國研究的焦點。相信在不久的將來隨著病毒分子生物學的發展及對PPV蛋白功能研究的深入，必將研制出安全、高效、廉價、易于保存和運輸的新型基因工程疫苗。

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（編輯：郭玉翠）

S858.28

A

1002-1957(2016)03-0125-04

2015-12-09

山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目（SDAIT-06-022-15）；山東省自然科學基金項目（ZR2013CQ006）；山東省自然科學基金青年基金項目（ZR2014CQ010）

李天芝（1985-），女，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動物傳染病診斷研究.E-mail：517493935@qq.com