豬圓環病毒2型的免疫學和病毒進化

翁善鋼

（外高橋出入境檢驗檢疫局，上海浦東新區200137）

豬圓環病毒2型的免疫學和病毒進化

翁善鋼

（外高橋出入境檢驗檢疫局，上海浦東新區200137）

豬圓環病毒2型相關性系統疾?。≒orcine circovirus 2-systemic disease,PCV2-SD）曾被稱為斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS），這種疾病造成豬只死亡率增加，生長變緩，對豬場造成嚴重的經濟損失。PCV2-SD的臨床癥狀包括消瘦、日增重降低、貧血、腹瀉、呼吸困難等。由于感染病毒豬只的B和T淋巴細胞耗竭，淋巴組織內可以觀察到廣泛的病變。血液和淋巴器官中B和T細胞的數量減少，與此同時，巨噬細胞/單核細胞的數量增加。目前的研究認為，PCV2是引起PCV2-SD或者其它豬圓環病毒病（Porcine circovirus diseases,PCVD）的一種必要而不充分的病原體。因為，PCV2在世界各地的豬場廣泛存在，但僅有一部分豬只會出現上述疾病，也就是說大部分豬只屬于PCV2亞臨床感染。

自2007年以來，一系列商業疫苗在豬場的使用顯著降低了PCV2感染引起的損失。盡管已有有效的疫苗，但PCV2仍然在不少豬群甚至是免疫豬群中流行傳播。PCV2具有一個環狀的單鏈DNA基因組，長度僅為1.7 kb。復制相關蛋白（Rep和Rep'）由ORF1編碼，衣殼蛋白（Cap）由ORF2編碼，ORF3和ORF4分別編碼參與細胞凋亡和抗細胞凋亡的蛋白。衣殼基因（cap）常被用于基因的系統發生學研究。根據系統發生學研究或PCV2的完整基因序列，目前PCV2被分成4種基因型，分別是PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d。PCV2具有較高的突變率，最近的研究稱疫苗的使用對PCV2的進化也產生了重要影響[1]。

在理想的條件下，對病原體的免疫應答導致病原體被清除或產生免疫記憶。與此相反，病原體在進化過程中采取的策略是規避和利用免疫系統來完成其生命周期。有些病原體，如PCV2，能夠在宿主長期存在，引起延長的促炎癥狀態，產生免疫病理作用。不同豬只感染PCV2后的結果有所不同。一些豬能夠產生足夠的體液和細胞免疫清除感染。不過，受到PCV2-SD影響的豬會出現嚴重的淋巴細胞耗竭。研究人員認為這是PCV2引起免疫抑制的主要原因。

1 PCV2的免疫調節能力

先天性的非適應性宿主免疫應答是應對病原體感染的早期屏障。這種反應在一種新的病原體入侵后立即激活。如果早期反應并不能清除病原體，適應性免疫應答就發生了。在對病原體防御的過程中，樹突細胞（dendritic cells,DC）起著重要作用。樹突細胞與巨噬細胞是最早遇到病原體的細胞，它們吞噬、消化病原體，將抗原呈遞給T淋巴細胞，引發適應性免疫。主要有兩種類型的樹突狀細胞：常規的樹突狀細胞（conventional DC,cDC）和漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid DC,pDC）。cDC的主要作用是抗原呈遞，pDC能生產Ⅰ型干擾素（interferon,IFN）。與其它病毒相似，PCV2能夠調節DC的活動。PCV2能夠被DC吞噬，但并不能夠在這些細胞中復制，也不會影響到這些細胞的生存。cDC的功能不會因為PCV2增加而受到損害，pDC的功能會受到病毒影響。在許多病毒感染的過程中，IFN-α通常是pDC誘導產生的。IFN-α的作用是誘導抗病毒狀態的出現。然而，PCV2對體外培養的pDC/單核細胞誘導產生IFN-α具有下調作用。與此相反，在體內，PCV2感染顯示出具有誘導IFN-α分泌的作用。這說明PCV2具有免疫刺激和抑制的雙重作用。具體來說，病毒的基因組或者部分基因組能夠調節細胞因子的反應，這可能是通過抑制/刺激CpG基序與細胞中的胞質或胞內受體相互作用進行的[2]。

表達PCV2感染另一個關鍵的細胞因子是多效性細胞因子IL-10。先天性細胞（巨噬細胞、DC）和適應性細胞（B細胞和CD4+和CD8+細胞的亞群）都可以產生IL-10。IL-10能夠抑制參與清除病原體的細胞，如巨噬細胞、Th1和NK（自然殺傷）細胞。關于IL-10在PCV2感染期間的重要性已有不少體內和體外研究。體外培養的PBMC，特別是單核細胞/DC/巨噬細胞群，IL-10的表達由PCV2誘導，非致病性PCV1并不能誘導表達IL-10。PCV2感染PBMC釋放出的IL-10能夠抑制IFN-γ、IFN-α和IL-12的產生[3]。單核細胞/DC/巨噬細胞被認為與IL-10的產生有關。這些細胞中IL-10的誘導可能的通路是通過Toll樣受體9（Toll-like receptor 9,TLR9）。TLR9是一種核內表達的受體，能夠識別未甲基化的DNA?；糚CV2-SD的豬的胸腺中IL-10的轉錄也有所增加，這通常還跟胸腺萎縮有關。由PCV2誘導產生的IL-10是引起患PCV2-SD的豬免疫紊亂的重要細胞因子。此外，全身性的IL-10水平與感染21天后血液中的病毒載量有關[4]。

2 針對PCV2的細胞和體液免疫反應

從胎兒到成年動物，針對PCV2感染的體液免疫應答都已有研究。PCV2在母豬子宮內感染會導致胎兒抗體的產生。子宮內的胎兒感染病毒后會增加針對PCV2的體液免疫應答。母源抗體可以通過胎盤進入胎兒，這些抗體可以在胎兒檢測到。事實上，母豬抗PCV2抗體的滴度越高，仔豬中檢測到抗體的可能性越大[5]。

仔豬出生后能夠獲得源自初乳中母源中和抗體的保護。而到了哺乳和保育期，這些主動獲得抗體的量會下降。母源抗體的減弱使得豬只在主動的血清轉換之后對PCV2感染更為易感。中和抗體在清除病毒方面是有效的。中和抗體不足與PCV2復制增加、嚴重的淋巴病變和形成PCV2-SD有關。有趣的是，在感染期間，抗體不僅針對Cap蛋白也針對非結構性的Rep蛋白。無論是健康的豬只，還是患PCV2-SD的豬只，抗cap的抗體比抗rep的抗體產生要早，滴度也要高。

最近也有不少報道研究了細胞免疫。這主要是因為PCV2抗體并不能夠提供充分的保護。細胞免疫，特別是IFN-γ分泌細胞（SC）的產生與PCV2在血清中的病毒載量呈負相關。在記憶抗原的刺激下，特異性IFN-γSC和T細胞能夠產生IFN-γ。研究顯示PCV2感染和疫苗接種后，細胞介導的免疫能夠增加。有趣的是，IFN-γSC對非結構Rep和結構Cap蛋白都具有特異性。PCV2-SD病豬出現B和T淋巴細胞減少是由PCV2感染引起的。值得注意的是，由B細胞和CD3+CD4+CD8+細胞來記憶/活化的Th淋巴細胞會被耗竭。細胞耗竭與形成PCV2-SD有關。疫苗接種和病毒感染都能引起記憶/活化Th細胞。這些細胞是抗原特異性的T細胞和記憶細胞。病毒感染或疫苗接種之后，抗原特異性記憶T細胞能夠長期存在，能夠在喚起抗原識別之后快速擴展。因此，這樣可以快速防止PCV2感染。更具體地說，PCV2特異性IFN-γ/TNF-α和共同產生的CD4+細胞在疫苗免疫或病毒感染之后，在控制和清除PCV2感染方面起著重要作用。有趣的是，這些細胞亞群能夠被所有的免疫/感染的豬只誘導產生，而特異性的抗體僅能在45%的豬只中檢測到。這些報道進一步強調了細胞免疫在感染動物中控制和清除PCV2的重要性[6]。

3 PCV2的進化

在過去的20年中，PCV2是最重要的豬病原體之一。目前，PCV2疫苗已廣泛用于商業化豬場。由于疫苗不能夠誘導殺菌免疫，因此即使接種了疫苗，病毒仍然可能在豬群中傳播。PCV2在免疫豬群中傳播的復制率（reproduction ratio,R0）為1.5，而在非免疫豬群中R0為5.2。R0測定的是感染期間，1頭豬造成的繼發感染的平均數量。因此，R0＞1則意味著病原體將維持在豬群中。由此可見，PCV2疫苗能夠有效降低感染壓力，但并不能夠將病毒清除出豬場[7]。

PCV2疫苗是基于Cap蛋白或完整病毒的。在系統發育分析研究中，cap基因用于將PCV2毒株分成4個基因型。目前，用于將PCV2分成不同基因型的遺傳距離＞3.5%。在2000年之前，PCV2a一直是最常見的基因型。不過，如今PCV2b已經取代PCV2a成為PCV2-SD暴發時最常見的基因型。PCV2c最早在丹麥被發現，發生的頻率較低。PCV2d是近幾年新出現的一種基因型，還在繼續進化中。不同基因型之間的全基因組差異在8%～12%之間。PCV2c的差異最大，PCV2d次之。不同基因型的衣殼蛋白的氨基酸序列差異在6%～15%之間。

PCV2的差異性是以1.2×10-3（替換/位點/年，substitution/site/year）的高進化速率產生的。作用于變異毒株的選擇作用會進一步塑造PCV2的進化。事實上，由于cap基因的突變，新的抗原的變異毒株出現了。此外，使用新一代的測序技術，能夠鑒別出低頻率的突變。低頻率的突變株并不適合特定的環境。不過，病毒會形成儲藏宿主使得病毒在不斷變化的環境中快速適應。換句話說，有時也會有有益的突變出現，它們在病毒群中出現的頻率會快速增長[8]。

rep基因是高度保守的，而cap基因含有更多的變異性。已有研究顯示，來自一頭豬的多克隆血清對同一基因型的不同分離毒株具有不同的抗體中和滴度。事實上，使用PCV2亞型毒株的單克隆抗體的研究，即使是單一的突變也可能導致抗原性不同的病毒。這些結果對PCV2這樣的病毒而言并不令人驚訝，因為它具有高度的進化率。生物學差異，如抗體被中和，與病毒的序列并沒有關系，而是取決于具體的病毒分離毒株。一些線性（在位點25～43，69～83，113～127，117～131，169～183和193～207）和構象（在位點47～85，165～200和230～233）的表位域已在Cap蛋白中被鑒定出來。已有研究顯示在負或正選擇下，這些區域含有位點。特別是非保守位點能在正選擇下找到，這些被認為是宿主免疫系統的目標位點。PCV2蛋白中的保守域是它們發揮功能的必要位點[9]。

當前的一個挑戰是了解PCV2疫苗接種對病毒進化的長期影響。從理論上說，有幾個方面表明目前的疫苗可以影響到PCV2的進化。疫苗已被廣泛應用，在幾個重要的養豬大國如美國、德國、西班牙，疫苗覆蓋了90%以上的豬只。豬群密度高使得各種傳染性病原體的傳播非常迅速。此外，盡管免疫了疫苗，PCV2仍然會傳播，因為疫苗并不能夠避免PCV2感染[10]。實際上，已有研究顯示免疫和非免疫豬群中流行的PCV2在基因組上有所不同。此外，新出現的PCV2d毒株是在患有PCV2-SD的免疫豬群中發現的。不過，在人工感染試驗中，當前使用的基于PCV2a的疫苗對PCV2d也是有效的。研究疫苗對病毒進化的作用，特別是病毒在免疫動物中能夠出現仍然有大量工作要做。

[1]Kekarainen T,Gonzalez A,Llorens A,et al.Genetic variability of porcine circovirus 2 in vaccinating and non-vaccinating commercial farms[J].J Gen Virol,2014,95:1734-1742.

[2]Fort M,Sibila M,Pérez-Martín E,et al.One dose of a porcine circovirus 2(PCV2)sub-unit vaccine administered to 3-weekold conventional piglets elicits cell-mediated immunity and signi ficantly reduces PCV2 viremia in an experimental model[J].Vaccine,2009,27:4031-4037.

[3]Kekarainen T,Montoya M,Dominguez J,et al.Porcine circovirus type 2(PCV2)viral components immunomodulate recall antigen responses[J].Vet Immunol Immunopathol,2008,124:41-49.

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[6]Koinig H C,Talker S C,Stadler M,et al.PCV2 vaccination induces IFN-gamma/TNF-alpha co-producing T cells with a potential role in protection[J].Vet Res,2015,46:20.

[7]Rose N,Grasland B,Bigault L,et al.Impact de la vaccination sur la transmission du Circovirus porcin de type 2(PCV-2)[J]. J Rech Por,2012,44:91-92.

[8]Cadar D,Cságola A,L?rincz M,et al.Detection of natural interand intra-genotype recombination events revealed by cap gene analysis and decreasing prevalence of PCV2 in wild boars[J]. Inf Genet Evol,2012,12:420-427.

[9]Kurtz S,Grau-Roma L,Cortey M,et al.Pigs naturally exposed to porcine circovirus type 2(PCV2)generate antibody responses capable to neutralise PCV2 isolates of different genotypes and geographic origins[J].Vet Res,2014,45:29.

[10]Opriessnig T,Gerber P F,Xiao C-T,et al.A commercial vaccine based on PCV2a and an experimental vaccine based on a variant mPCV2b are both effective in protecting pigs against challenge with a 2013 U.S.variant mPCV2b strain[J].Vaccine,2014,32:230-237.

（編輯：柳青）

每天喝適量咖啡益壽延年

【英國《每日電訊報》網站11月16日報道】一項新研究顯示，每天喝3到5杯咖啡也許能夠益壽延年。

科學家發現，適量飲用咖啡能夠降低人們因心臟病、帕金森癥等神經系統疾病和2型糖尿病而過早死亡的風險。

喝咖啡似乎還能降低自殺風險—但與癌癥死亡率看似沒有關聯。

所喝的咖啡中是否含有咖啡因沒有差別。據認為，咖啡的好處與咖啡中除刺激性物質之外的植物化合物有關。

領導這項研究的美國哈佛大學陳曾熙公共衛生學院科學家丁明（音）說：“咖啡中的生物活性物質會降低胰島素抵抗和全身炎癥反應。這也許能夠解釋我們的一些發現。不過，還需要進行更多研究以調查產生這些作用的生物學機制?！?/p>

發表在美國《循環》月刊上的這一研究成果源自對三項大型研究的匯總分析。共有208 501名男性及女性參與了正在進行中的這三項研究。

研究人員利用30年來每4年一次的飲食調查問卷對喝咖啡的影響進行了評估。

與較少喝咖啡或不喝咖啡相比，適量飲用咖啡能顯著降低因各種原因死亡的風險。

這項分析還考慮到了可能影響研究結果的其他因素，包括吸煙、身體質量指數（BMI）、體育鍛煉水平、飲酒和日常飲食。

研究報告的聯合作者、陳曾熙公共衛生學院教授胡丙長說：“這項研究提供了進一步證據，證明適量飲用咖啡可能對健康有好處，降低因多種疾病而過早死亡的風險?！?/p>

英國心臟基金會的心臟科主任護士埃米莉·里夫說：“應該記住，如果想保持心臟健康，真正重要的是保持健康的生活方式，而不是喝了多少咖啡。”

（轉自參考消息[N]，2015-11-18）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)05-0108-03

2016-07-05

翁善鋼（1985-），男，江蘇常熟人，碩士，主要從事各類動物疫病流行病學及其防控對策研究.E-mail：sgweng@163.com