輪狀病毒疫苗研究進展

牟迪，夏偉，朱子健，張宇輝，朱慶虎

（1.哈爾濱維科生物技術開發公司，黑龍江哈爾濱150001；2.中國農業大學生物學院，北京海淀100193）

豬病防制與保健

輪狀病毒疫苗研究進展

牟迪1，夏偉1，朱子健2，張宇輝1，朱慶虎1

（1.哈爾濱維科生物技術開發公司，黑龍江哈爾濱150001；2.中國農業大學生物學院，北京海淀100193）

輪狀病毒（Rotavirus,RV）是引起多種幼齡動物以及嬰幼兒腹瀉的重要病原體。輪狀病毒最早是Mebus在1969年從犢牛糞便中發現的，1973年澳大利亞科學家Bishop等在患有嚴重腹瀉嬰兒的十二指腸黏膜及糞便中發現了一種新的病毒粒子[1]。在非洲和亞洲的撒哈拉以南地區，據調查超過三分之一的嬰幼兒腹瀉及胃腸炎疾病由輪狀病毒引起，每年導致50萬～60萬嬰幼兒死亡[2-3]。歐洲和美國預防和治療該類疾病的直接和間接醫療費用高達數10億美元[4]。自從1974年英國Woode和Bridge首次從豬體分離出輪狀病毒后，緊接著輪狀病毒引起的仔豬腹瀉相繼被澳大利亞、北愛爾蘭、美國、法國等國家報道，輪狀病毒在豬中的傳播開始被世界各國重視。我國首次出現豬輪狀病毒（Porcine Rotavirus, PRV），是1982年闕玲玲于中國臺灣發現，之后江蘇、山東等地也陸續報道[5]。不同地區感染輪狀病毒的普遍性說明，單純靠提高衛生水平對輪狀病毒的感染率和發病率影響不大。此外，雖然輪狀病毒感染引起的臨床癥狀可用一些藥物來緩解，但暫時還沒有研制出用于治療輪狀病毒感染的特效藥物[6]。因而，加強對輪狀病毒感染機制的研究，為預防輪狀病毒感染開發安全有效的疫苗具有必要性。

1 輪狀病毒的病原學特征和血清型

輪狀病毒（Rotavirus,RV）屬呼腸病毒科，輪狀病毒屬，病毒無囊膜，呈二十面體對稱，直徑為65～75 nm。在電子顯微鏡下觀察，輪狀病毒是帶有短纖突且外緣光滑近似輪狀的粒子。由外層衣殼（VP7和VP4）、中間衣殼（VP6）和內層衣殼（VP2）3部分組成病毒粒子。通常只有包裹3層衣殼蛋白的粒子才具有傳染性[7]。中央為一個致密的六角形核心，直徑37～40 nm，即芯髓。被內層衣殼、RNA依賴性RNA聚合酶（VP1）及修飾酶（VP3）包裹的病毒基因組，由11個不連續的dsRNA組成，編碼6個結構蛋白（VP1～VP4/VP6/VP7）和6個非結構蛋白（NSP1～NSP6），除第11個節段含有兩個開放閱讀框并編碼NSP5和NSP6外，其他每節段分別編碼一種蛋白[8]。不同的輪狀病毒毒株在宿主體內共感染，可能會造成11個基因節段發生重配，導致新的輪狀病毒變異株的產生。

輪狀病毒編碼的VP6蛋白位于中間衣殼，因其具有高度保守性，常稱之為群抗原或診斷抗原，根據其抗原性的不同可以將輪狀病毒分為A～G 7個種群，感染人的輪狀病毒大多屬于A群，根據結構蛋白VP4和VP7可以把RV分成G、P兩個血清型，包括24個G血清型和33個P血清型[9]，G血清型分型取決于VP7中和抗原，而P血清型分型取決于VP4血凝素抗原。目前，G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]和G9P[8] 5種血清型的輪狀病毒是危害人類健康最為重要的毒株[10]，其中G1P[8]和G3P[8]型在我國最為常見。

2 輪狀病毒感染的病理變化

RV感染后主要侵犯空腸的微絨毛上皮細胞，使其凋亡。病變細胞脫落，微絨毛變短、變鈍。原位于隱窩底部擁有分泌功能的細胞取而代之。小腸功能喪失源于以上病變，水與電解質分泌增加，吸收減少，引起分解。另外小腸微絨毛上皮細胞功能出現障礙，降低雙糖酶分泌，乳糖起不到被消化吸收的作用，在腸道內積聚從而誘發滲透性腹瀉。仔豬感染輪狀病毒的病變主要限于消化道，胃弛緩，內充滿凝乳塊和乳汁，小腸壁變薄，呈半透明狀，腸內容物呈漿性或水樣，灰白或灰黑色，腸系膜淋巴結水腫，膽囊腫大，腸絨毛萎縮。

起初認為，嬰幼兒及動物感染輪狀病毒僅限于胃腸道內，但隨著深入研究得出，輪狀病毒感染后不僅破壞腸道黏膜系統，同時全身多個器官可以被侵犯源于感染引發的病毒血癥，更可導致感染幼齡動物死亡的后果。RV易感的腸外器官與組織主要有支氣管與肺泡、心、肝、腎、胰、膽等。Gilger等研究表明，嬰兒時期的肝臟損害與輪狀病毒感染有緊密關聯。此外，感染輪狀病毒后，根據肝組織內RV-RNA強陽性染色較密集的分布，結合肝細胞濁腫及明顯脂肪病變等病理改變，提示輪狀病毒擁有嗜肝組織的能力。姚英民等在一例RV感染患兒的腦脊液、腹水和肺組織中均檢出RV，病理改變除典型RV胃腸炎外，以肺腦病理改變為著稱，可見水腫、瘀血、出血、大量組織和淋巴細胞浸潤[11]。任小梅等報道276例患兒中69例患兒在腹瀉的同時合并有呼吸道感染，其中上呼吸道感染、支氣管炎和支氣管肺炎均有發生，通過胸片檢查可以看出肺紋理增粗，小斑片或條索狀陰影[12]。

3 輪狀病毒檢測方法

3.1 抗原檢測

分離培養是輪狀病毒病原檢測的經典方法。1980年Wyatt等建立了人輪狀病毒Wa株分離培養技術檢測方法，將毒株在無菌仔豬中連續傳代11代后轉接到非洲獼猴腎細胞中培養獲得成功[13]。2012年庫旭鋼等采集腹瀉仔豬糞便后接種于MA-104細胞，分離鑒定后判定為RV[14]。由于分離病毒對培養條件要求高，分離時間較長，且操作過程繁瑣，耗費較多，不適于在基層推廣應用。免疫熒光技術檢測輪狀病毒是把發病早期的空腸或內容物制成壓片，用輪狀病毒熒光抗體染色，可通過鏡下觀察腸絨毛上皮的胞漿區域是否檢測到熒光。

在分子生物學檢測方法中，RT-PCR是目前應用最多的快速診斷方法，具有操作簡單、診斷快速、敏感性和特異性高等特點。2006年Song等應用多重RT-PCR方法檢測157份仔豬臨床腹瀉病料，其中RV的陽性率為13.2%[15]。隨著分子生物學技術的不斷發展，熒光定量RT-PCR技術在RV的診斷上也得到了應用。通過與普通RT-PCR方法進行對比分析后發現，熒光定量RT-PCR的靈敏度比普通的RT-PCR敏感性要高100倍。熒光定量RT-PCR檢測技術靈敏度與特異性都比較高，可對樣品進行快速、大量檢測。環介導等溫擴增技術能在60～65℃情況下，經過具備鏈置換特征的Bst DNA聚合酶實現靶序列的擴增，只需要固定溫度條件就能擴增出目的核酸片段，經過Screen GreenⅠ染色或者離心沉淀觀測結果，與常規RT-PCR相比，可以省略模板的熱變性、溫度的循環、電泳條帶及紫外線燈觀測等一系列過程。基于核酸序列的擴增技術（Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA）是RNA體外擴增技術的一種，可以理解為RNA-PCR。寇曉霞等研究顯示，NASBA能檢出最高核酸水平為50 pg，RT-PCR能檢測出最高核酸水平為100 pg[16]。若標本中含有靶細菌和病毒時，NASBA-ELISA系統就會產生非特異性信號。經過研究進一步證實，利用該系統檢測快速、簡便，具有靈敏度高、特異性強的優點。

3.2 抗體檢測

ELISA檢測方法的優點在于它的操作過程比較簡單、便捷，重復性比較高，高通量、價格低等。1985年，ELISA被WHO（世界衛生組織）推薦為人類輪狀病毒（HRV）的檢測方法。目前，廣泛應用于RV檢測的是雙抗體夾心ELISA法，可根據檢測目的的不同設計包被抗體與檢測抗體。相對于過去采用的高效價抗血清和多克隆抗體，單克隆抗體技術不僅克服了體外培養病毒的限制，減少了對高效價免疫血清的需求，提高了特異性及靈敏度，還可以進行血清分型和毒株鑒別，適用于臨床大規模檢測和流行病學調查。Zhu等以原核表達的RV VP7蛋白作為診斷抗原，建立了檢測RV抗體的間接ELISA方法[17]。Barman等對位于印度Assam地區的528份豬血清樣品進行了間接ELISA檢測，其中RV陽性率占51.1%，高于豬傳染性胃腸炎病毒（39.4%）和豬流行性腹瀉病毒（21.2%），約13.6%的豬只血清樣品中含有以上3種病毒的抗體[18]。

乳膠凝集試驗檢測輪狀病毒具備很多優點，如操作簡便、檢測時間短、對試驗儀器要求不高等。對檢測結果的判定只需2～3 min，可進行快速篩查，是適合應用于基層檢疫部門的檢測方法，但如果采集了含有較多油脂或其他懸浮物的腹瀉樣品，不能徹底離心，就會形成影響檢測的非特異性凝集物，造成結果不準確。有國外的試驗顯示，乳膠凝集試驗檢測糞便樣品的靈敏度為87%，特異性為73%～80%[19]。膠體金免疫技術無需特殊儀器，無污染，價格低廉，結果直觀，是目前檢測輪狀病毒最簡便、最快速的方法。研究顯示，將膠體金顆粒用輪狀病毒結構蛋白VP6單克隆抗體標記，選用RV多克隆抗體作為檢測線，羊抗鼠IgG作為質控線，成功地制備了檢測輪狀病毒的膠體金試紙條[20]。

4 輪狀病毒疫苗的研究進展

4.1 人輪狀病毒疫苗

作為威脅人類和動物健康的第二大腹瀉疾病，輪狀病毒成為引起全世界人類和動物嚴重腹瀉和脫水的主要誘因。發展中國家與發達國家在輪狀病毒感染方面具有類似情況，輪狀病毒腹瀉的發病率不會隨著公共衛生條件的改善而減少。營養狀況對發病危險的重要性也遠低于細菌性腹瀉。另外，流行病學的研究表明自然感染輪狀病毒后，隨后感染的發病率和嚴重程度呈下降趨勢。因此，預防輪狀病毒感染行之有效的方法是疫苗。

目前，人輪狀病毒疫苗主要以口服活疫苗為主。口服活疫苗在有效地誘導局部黏膜免疫后，能產生抗體和細胞介導的免疫反應，具有同天然感染作用途徑相一致的特點。不同國家和地區單價疫苗的保護性不同，表明輪狀病毒各血清型之間交叉保護性差。通過使用多價疫苗或各國各地區根據本地流行株研制的有針對性的疫苗可以預防輪狀病毒。1998年美國正式批準了一種由人-恒河猴輪狀病毒重配的四價疫苗（Rota shield）上市，雖然該疫苗在各地區的保護率達50%以上，但是后來流行病學協會發現該疫苗能增加部分兒童出現腸套疊的幾率，從而導致該疫苗在1999年6月被停用[21]。近年來，正是傳統疫苗自身存在的缺陷，使得人輪狀病毒基因工程疫苗也展開研究。被看作第3代疫苗的DNA疫苗，從1992年開始作為一種新型疫苗迅速發展。國內外對輪狀病毒DNA疫苗的研究都有報道。周旭等將輪狀病毒G1型Wa株的VP7基因克隆到真核表達載體pCDNA3 1（+）中，經Sepharose CL4B柱層析，獲得純化的質粒，通過肌肉注射和皮下注射，免疫BALB/c及F1小鼠后，產生了抗輪狀病毒Wa抗體。其中F1小鼠的抗體應答高于BALB/c小鼠，肌肉注射優于皮下注射[22]。

4.2 動物輪狀病毒疫苗

滅活疫苗不存在毒力返強的危險，使用相對安全，方便運輸和儲存，但是由于不能保證足夠的抗原含量，通常導致免疫效果不佳。史月明利用我國豬輪狀病毒分離毒株JL94株制備油乳劑滅活疫苗[23]。2008年姜英等將G1、G2、G3、G4四價輪狀病毒滅活疫苗免疫小鼠，能刺激機體產生針對輪狀病毒的特異性IgG抗體，但IgA應答較弱，表明該四價輪狀病毒滅活疫苗具備很好的免疫原性[24]。張儉偉等將牛輪狀病毒（CHLY株）進行甲醛滅活，并分別制備油乳佐劑疫苗和鋁膠佐劑疫苗，免疫小鼠和家兔，結果表明在小鼠和家兔體內均檢測到高水平的特異性血清抗體，并且在母兔初乳仍可檢測到抗體的存在[25]。

弱毒疫苗在預防豬RV感染上受到世界各國的廣泛應用，輪狀病毒（RV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）是引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原，往往不單由其中一種引起發病，混合感染的情況很常見，故為了達到更好預防仔豬腹瀉的效果，通常與TGEV、PEDV其中1種或2種病毒一起制成聯合弱毒苗。國外疫苗有美國RV弱毒苗、RV-TGEV二聯弱毒苗和俄羅斯的三聯弱毒苗。由哈爾濱獸醫研究所研制的豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒二聯凍干苗，經過多年的現地實踐證明，此苗用于兩種豬病毒性腹瀉的預防，安全有效。此外，哈爾濱獸醫研究所研制的豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎和豬輪狀病毒三聯活疫苗于2015年3月問世，填補了我國豬用RV疫苗的空白。主動免疫接種后7 d產生免疫力，免疫期為6個月。妊娠母豬于產仔前40 d后海穴位（即尾根與肛門中間凹陷的小窩部位）接種，20 d后二免，仔豬被動免疫的免疫期至斷奶后7 d。

對于亞單位疫苗的研究，現在已經在大腸桿菌等表達系統中成功的表達了輪狀病毒不同的結構蛋白，使得不同結構蛋白的作用以及亞單位疫苗的研制成為可能。亞單位疫苗具有儲存、運輸等過程當中效價很穩定、無副作用等多種優點。而核酸疫苗由于兼具亞單位疫苗的安全性，以及弱毒疫苗的有效性，能同時誘導機體產生體液和細胞免疫應答，能發揮一種疫苗預防多種傳染病的作用，目前還尚在研究階段，應用于防制傳染病的實踐還需更深入研究。在轉基因疫苗的研究中，已經有許多人類和動物蛋白基因轉入到植物中表達蛋白，來獲得抗原。張二芹等成功地將豬輪狀病毒內殼蛋白VP6基因轉化到煙草中，從而奠定制備新型豬輪狀病毒轉基因植物疫苗的基礎[26]。

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（編輯：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)04-0089-03

2016-06-04

牟迪（1988-），男，吉林伊通人，碩士，主要從事畜用疫苗技術服務工作.E-mail：281032446@qq.com