豬流行性腹瀉的流行特點、診斷和防控技術

李明波，宋忠旭，董斌科，孫華，雷斌，郭銳，梅書棋

（湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所、動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢430209）

豬流行性腹瀉的流行特點、診斷和防控技術

李明波，宋忠旭，董斌科，孫華，雷斌，郭銳，梅書棋

（湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所、動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢430209）

豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一種豬的高度接觸性傳染病，感染豬以急性腸炎、水樣腹瀉、嘔吐為主要特征。20世紀80年代我國首次報道并鑒定豬流行性腹瀉病毒，隨后該病毒成為引起豬病毒性腹瀉的常見病毒。2010年底，由PEDV變異毒株引起的PED大規模暴發，給養豬業帶來重大經濟損失。文章主要針對當前PED在我國的流行情況、診斷技術、疫苗和防控策略等方面進行闡述，以期給該病的防控提供借鑒和參考。

豬流行性腹瀉；流行情況；診斷技術；防控

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的豬的腸道傳染病，不同年齡階段的豬都可感染，本病對初生仔豬的危害最大，5日齡以內的仔豬，由于腹瀉和嘔吐而造成的嚴重脫水，發病率和死亡率可達100%。自2010年以來，我國10多個省市和地區大范圍暴發了豬流行性腹瀉，導致大量的新生仔豬死亡，給我國養豬業造成了巨大經濟損失。經大量的病原學和流行病學研究證實，引起此次腹瀉的病原主要為PEDV變異毒株[1-2]。

1 PED的流行情況

PED于1971年首次在歐洲發現，1976年在比利時分離得到第一株病毒，命名為冠狀樣病毒CV777株[3]。1992年以后在韓國和日本暴發，PEDV陽性檢出率為50.4%（1 258例）[4]。在中國，PEDV于1982年首次被分離，自20世紀90年代以來，PED在中國26個主要城市和地區養豬場連續暴發，造成全國養豬業巨大的經濟損失。

2010年10月，中國南方部分地區開始大規模暴發PED疫情，短期內疫情迅速擴散至全國，即使在疫苗免疫過的豬場，哺乳仔豬也未能獲得保護，患病仔豬主要表現為黃色水樣腹瀉、消瘦和脫水死亡，隨后經過病毒全基因組測序證實導致本次PED大規模暴發的病原為PEDV變異毒株[5-6]；楊漢春等也于2011年在我國部分地區15個豬場采集腹瀉仔豬的臨床樣本234份，得出PEDV陽性率為82.1%，TGEV陽性率為5.6%，該研究表明豬流行性腹瀉病毒是引起仔豬腹瀉的最主要病原，以纖突蛋白編碼基因（S基因）出現缺失、插入和突變為特征的變異毒株和傳統CV777毒株共存，而傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和輪狀病毒（ARV）在不同地區的感染水平有所差異。2013年PEDV變異毒株首次在美國流行，并蔓延到加拿大和墨西哥，現在PEDV已經在歐洲、亞洲、美洲等多個國家廣泛流行。

2 中國流行PEDV的分子特征

PEDV與TGEV同屬冠狀病毒，屬有囊膜單股正鏈RNA病毒，長約28 kb，全基因組包括5'非編碼區（UTR），3'UTR，至少7個開放閱讀框（ORF），編碼4個結構蛋白（S、E、M、N）和3個非結構蛋白（復制酶la和lb，以及ORF3），基因組上的順序為5'-復制酶（la/lb）-S-ORF3-E-M-N-3'[7]。在PEDV基因遺傳進化分析中，尤其以S蛋白、N蛋白、M蛋白和ORF3研究得最多。

為了分析PEDV毒株的遺傳背景，研究者通過對PEDV全基因組進行進化樹分析，將PEDV毒株分為G1（經典毒株）和G2（新型毒株）兩個基因型，G1和G2分別含有兩個亞型G1a、G1b和G2a、G2b。G1包括經典毒株、疫苗株及其它細胞適應培養株等，主要以CV777、LZC、SM98為代表的經典株，其它還包括韓國DR13弱毒株和國內早期分離的毒株；G2則均為2010年以后國內分離的PEDV變異毒株和北美新分離的PEDV變異株。李文濤等根據PEDV S基因進行核苷酸同源性分析發現，PEDV同群間核苷酸相似性從95.1%～100%不等，不同群間相似性從88.7%～96.7%不等[8]。相對于CV777等經典毒株，目前中國主要流行的PEDV毒株已經發生了較大變異，通過比較PEDV變異毒株與經典毒株的編碼基因發現，變異病毒的S基因（尤其是S1區）變化最大，變異株與經典株CV777相比，S1區域（1～2 217 nt）主要存在3個插入區域和一個缺失區域。通過序列分析發現，PEDV具有遺傳多樣性，同時也證明新型病毒可通過重組機制產生。此外，比較PEDV變異株和經典毒株S1的抗原中和表位發現，3個重要表位均發生突變，表明現行使用的經典株的滅活或弱毒疫苗均不能提供很好的保護[9]。

3 PED發病機理及臨床特征

PEDV通常首先感染養殖場陰性肥育或后備豬，累積的病毒感染懷孕母豬使之帶毒，然后傳至產仔舍，隨后亞臨床感染的母豬最終傳染給哺乳仔豬。根據筆者最近觀察，部分養殖場哺乳仔豬發生腹瀉時，母豬往往不表現出明顯的腹瀉癥狀，這可能與母豬本身免疫過疫苗或者感染的PEDV毒力有關。

PEDV感染豬體后首先在小腸絨毛上皮細胞增殖，造成線粒體損傷腫脹和營養物質吸收不良，進而引發上皮細胞損傷脫落，腸絨毛萎縮及吸收面積減小，最終導致滲出性脫水死亡。臨床上表現為新生哺乳仔豬水樣腹瀉、凝乳性嘔吐及脫水，10日齡仔豬感染出現腹瀉2～4天后，死亡率50%～100%。產房呈跳躍式傳播，頭胎和低胎齡母豬所產仔豬發病率較高，生物安全較差的養殖場哺乳仔豬可能會出現反復感染PEDV的現象；日齡較大的豬發病1周后可自然康復，死亡率低，但可導致體重下降和飼料利用率下降[10]。

消化道傳播是PED主要的但并不是唯一的傳播途徑。王新平等發現，PEDV可在呼吸道內復制，經呼吸道分泌物向外排毒后感染易感豬群[11]。除了常規的糞口途徑傳播，PEDV還可通過感染母豬乳汁等途徑傳播。此外，PEDV的傳播媒介還包括運輸車輛、未經嚴格消毒的生產用具、筒靴、衣物、病毒污染的水源、飼料（血漿蛋白）、燕八哥、蒼蠅等。PEDV潛伏期較短，豬只從接觸病毒到表現出臨床癥狀只需12～24小時，排毒周期一般為3～4周。

Hesse等給4周齡豬口鼻接種PEDV后，研究了病毒的組織定位、排毒方式、攜帶、抗體應答和氣溶膠傳播等發現，接種后21天大部分豬的糞便拭子和鼻拭子檢測都為陰性，有些豬排毒時間可持續到接種后的35天；經免疫組化檢測發現，豬只氣管、肺臟和支氣管淋巴結、脾臟等其它內臟組織均為PEDV陰性。

4 PED的診斷技術

4.1 PEDV病原學診斷

流行性腹瀉和傳染性胃腸炎的臨床癥狀相似，乳豬均表現嘔吐、水樣腹瀉至脫水酸中毒死亡（糞便腥臭），因此在實驗室對PEDV進行鑒別檢測是非常有必要的。一般采集剛發病仔豬的糞便和腸道內容物、母豬乳汁進行病原學鑒別診斷，診斷方法主要包括免疫熒光（IF）、免疫組化技術、電鏡觀察、RT-PCR（熒光定量）等。

PEDV變異毒株雖然在S基因上變化顯著，但在M基因上還是相對保守，針對M基因的診斷方法依然有效。如張坤等建立了針對PEDV M基因、TGEV N基因、ARV（輪狀病毒）VP7基因的多重RT-PCR檢測方法[12]。近年來，國內外學者基于PEDV S、ORF3、M基因陸續開展了針對流行性腹瀉變異毒株和經典毒株的鑒別診斷及熒光定量RTPCR診斷技術的研究，為豬急性腸炎病毒的檢測提供了快速、敏感的實驗室診斷方法[13-14]。同時，基于N、M蛋白的單克隆抗體技術ELISA（酶聯免疫吸附試驗）檢測方法也得到了初步應用，但該方法的特異性、敏感性和穩定性等方面還需要進一步研究。

4.2 血清學診斷技術

血清學方法是另外一種有效監測豬群中PEDV的手段，目前間接免疫熒光試驗（IFA）和中和抗體試驗是常用的血清學方法。基于PEDV S基因的S1部分，Gerber等用建立的S1-ELISA方法對239個場的血清樣品進行檢測，診斷的敏感性為100%，特異性為94%。進一步研究表明，豬只抗PEDV的IgA、IgG抗體含量在人工接種PEDV后3～4周逐漸減少，IgA抗體用于監測體液免疫應答的特異性更高，可有效反映PEDV被動免疫保護能力。國內學者丁振江等也建立了基于PEDV S1D蛋白為包被抗原的IgA-ELISA抗體檢測方法，為臨床評價母源黏膜抗體保護力提供了基礎[15]。

5 PED的免疫預防

5.1 PED疫苗

國內最先研制的PED疫苗是組織滅活苗。1995年，馬思奇等研制了商品化的PEDV和TGEV二聯滅活疫苗，該二聯苗能夠有效地預防TGEV和PEDV的感染，經后海穴注射，TGEV和PEDV主動免疫的保護率分別可達100%和92%，被動免疫的保護率可達87.9%和84.2%。1998年，佟有恩等研制了PEDVTGEV弱毒二聯苗，主動免疫與被動免疫的保護率為97.7%和98%。這兩種商品化疫苗使用的PEDV毒株是CV777株，在2010年前，這兩種疫苗為控制PEDV和TGEV的傳播發揮了重要作用。從2010年至今，我國豬場廣泛采用自家疫苗、商品化疫苗和返飼等方式來控制PED的暴發，但效果并不理想，主要是缺乏對PEDV變異株的免疫機理和致病性的了解。

1997年以來，日本和韓國先后在Vero細胞上傳代培養開發了PEDV弱毒疫苗（P5-V和DR13株），試驗表明弱毒疫苗通過口服比肌注效果更好，因為口服疫苗后仔豬的死亡率相對于肌注的要低，并且抗體水平要高得多。2013年，美國研制使用了兩種PEDV滅活疫苗，結果表明該疫苗免疫4周齡的仔豬后可誘導較強的體液免疫。

2015年，中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所研制的TGEV（H弱毒株）、PEDV（CV777弱毒株）和ARV（G5型）三聯活疫苗開始應用于臨床豬場。鑒于目前流行的PEDV變異株與經典毒株存在較大差異，因此有必要針對流行的變異毒株研制新的疫苗。當前中國研究者開始以PEDV變異毒株為基礎，初步研制了滅活和弱毒疫苗，動物試驗結果顯示，兩種疫苗能對PEDV變異毒株提供很好的免疫保護。

新型疫苗方面，我國研究者徐麗麗等開展了PEDV重組減毒的沙門氏菌口服疫苗的研究，Liu等構建了表達PEDV-N基因或S1基因的重組乳酸桿菌，研究表明口服后能有效刺激仔豬腸道產生黏膜免疫應答。這些研究為研制更高效的PEDV口服疫苗奠定了基礎[16]。

5.2 PED的免疫措施

由于PEDV是腸道病毒，黏膜免疫在抵抗PEDV的感染中發揮著重要作用，因此通過消化道給予疫苗免疫（主動和被動免疫），以此激發腸道黏膜免疫（尤其是sIgA抗體的產生）應是預防該病的最佳選擇。當前PEDV疫苗和免疫仍然存在一些問題：一是滅活疫苗肌注后只能誘導乳腺產生低滴度的IgG，并且IgG持續時間短，不能產生有效的黏膜免疫（IgA）抗體和細胞免疫反應，可在活病毒感染或弱毒苗接種后，利用新毒株制備的疫苗重復接種增強其免疫保護效果；二是PEDV在Vero細胞上培養困難，導致弱毒疫苗滴度低，其次弱毒疫苗口服后在豬胃腸道增殖能力下降，產生保護力有限。

鑒于目前PEDV的特點和當前疫苗免疫效果，可以使用低代次的PEDV口服免疫的同時結合變異株的自家疫苗（由有資質的科研院所制備）或滅活疫苗進行聯合免疫種母豬，可以達到較好的免疫效果。

6 PED的臨床控制

6.1 緊急控制措施

豬場發生PEDV疫情時應及時確診并采取有效措施，一是發病肥育豬或后備豬棟舍應隔離和封鎖，避免病毒在場內擴散。二是對產前4周以上妊娠母豬可緊急接種疫苗，4周以內母豬轉入單獨產房（消毒干燥），已感染PEDV的產房哺乳母豬及小豬由專人護理，并作隔離處理，停止疫苗注射等工作。三是對10日齡以內豬只實行人工乳喂養和同一產房內未發生腹瀉健康母豬的寄養，脫水嚴重的仔豬應及時淘汰處理。四是日齡較大仔豬及時轉出產房，進行補液治療，或在料槽中補充口服補液鹽水和蒙脫石散類吸附劑，并對發病豬舍隔離、徹底消毒干燥及空欄凈化。

6.2 日常預防措施

加強飼養管理，減少環境應激，提升母乳（初乳）質量和水平。穩定控制產房和保溫箱的溫、濕度。免疫控制PCV2、凈化豬場偽狂犬病和豬瘟等疾病。對出生1～3天仔豬可口服微生態和免疫因子復合制劑。強化隔離和生物安全措施，豬場人員及進出車輛嚴格消毒以及對發病豬的無害化處理等，選用敏感的消毒劑（如戊二醛噴霧、甲醛熏蒸等），豬舍外部環境（趕豬通道、上豬臺、糞道等）潑撒生石灰或燒堿消毒。產房消毒后保持干燥至少7天以上再轉入下一批次豬。

7 展望

當前PED仍然是嚴重危害我國養豬業的重要疾病之一。由于PEDV具有高度變異的特性，發生病毒性腹瀉疫情的豬場可能是多種病原并存，這給PED的診斷、疫苗研制及臨床防控帶來了極大的挑戰。隨著PEDV變異毒株的廣泛流行，關于PEDV的基礎研究在國內外也得到了快速推進，目前我國已解析了60多株PEDV的全基因組及其遺傳特征，并開展了PEDV分子流行病學、病毒的增殖培養特性、感染和致病機理、病毒與宿主免疫系統相互作用等方面的研究，將有助于今后PED診斷試劑、新型疫苗和臨床防控技術的研發，為預防和控制PED的傳播發揮重大作用。

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（編輯：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)05-0089-03

2016-06-28

科技部科技支撐計劃“優良種豬高效利用關鍵工程化技術集成與示范”（2014BAD20B01）；農業部國家生豬產業技術體系武漢綜合試驗站項目（CARS-36）；十三五創新團隊項目（2016-620-004-001）

李明波（1982-），男，湖北宜都人，助理研究員，碩士，研究方向為豬傳染病的病原學診斷和臨床防控技術. E-mail：lmb409@126.com

梅書棋，研究員，研究方向為豬遺傳育種. E-mail：msqlfe@163.com