豬流行性腹瀉病毒分子生物學檢測方法研究進展

李天芝，于新友，梅建國，李峰，沈志強

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東濱州256600）

豬流行性腹瀉病毒分子生物學檢測方法研究進展

李天芝1，于新友1，梅建國2，李峰2，沈志強2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東濱州256600）

文章綜述了豬流行性腹瀉病毒分子生物學檢測方法，主要包括核酸探針、常規PCR方法、套式PCR方法、多重PCR方法、熒光定量PCR方法、環介導等溫擴增等6種方法，對豬流行性腹瀉防控有一定的參考價值。

豬流行性腹瀉病毒；分子生物學；檢測方法

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）可感染豬導致豬流行性腹瀉，該病的主要特征是豬嘔吐、脫水和水樣腹瀉，是一種高度接觸性腸道傳染病，多發生于冬、春季節，但夏季也可發病。該病最初發生在英國，隨后世界各地均有相關報道，我國于1976年最初報道該病。各日齡的豬均可感染PEDV發病，其中哺乳仔豬受到的危害最嚴重，給養豬業造成了巨大的經濟損失。分子生物學檢測方法以檢測速度快、靈敏度高、特異性好等特點已經廣泛應用于細菌和病毒病的檢測，并展示良好的應用前景。筆者就目前國內外PEDV檢測的分子生物學方法的最新研究進展進行綜述，為豬流行性腹瀉的診斷和防控提供參考。

1 核酸探針

核酸探針又稱核酸雜交，利用核苷酸堿基順序互補的原理，用特異的基因探針即識別特異堿基序列（靶序列）的有標記的一段單鏈DNA（或RNA）分子，與被測定的靶序列互補，以檢測被測靶序列的技術。Kim等[1]將標記地高辛的核酸探針（0.1 ng/μL）加入300 μL的標準雜交緩沖液中，95℃加熱10 min后，在冰上淬火，標記地高辛的核酸探針可以與人工感染仔豬的PEDV的核衣殼蛋白基因進行堿基互補配對，通過透射電鏡下觀察到仔豬的空腸和結腸的上皮細胞的胞質呈黑色，從而可以證明是PEDV感染的仔豬腹瀉，該試驗在79個陽性樣本中檢測出71個是陽性的，檢出率為89.87%。

2 常規PCR方法

PCR方法是根據目的片段設計引物，借助儀器和DNA聚合酶體外大量擴增部分或全部目的片段，是一種快速、簡便、特異的診斷方法。陳宏智等[2]建立了檢測PEDV的RT-PCR檢測方法，結果顯示，該法對豬瘟病毒（CSFV）、大腸桿菌、偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環病毒2型（PCV2）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）均為陰性，具有特異性。該法最低可檢測到2.3×10-3μg/μL的PEDV RNA，將建立的方法與商品試劑盒相比較，分別對126份臨床疑似PEDV感染的病料進行檢測，結果顯示，二者的符合率為100%。于新友等[3]建立了檢測豬流行性腹瀉病毒一步法RT-PCR方法，并對其特異性、敏感性進行了研究。結果顯示，該法對豬流行性腹瀉病毒（PEDV）擴增結果為陽性，對照毒株擴增結果均為陰性，對豬流行性腹瀉病毒檢測的靈敏性為100 pg總RNA量。李長龍等[4]在PEDV ORF3基因缺失區域兩端設計合成引物，建立了可對PEDV野毒株和疫苗株進行鑒別診斷RT-PCR方法，野毒株擴增產物為319 bp，疫苗株擴增產物為270 bp，用該鑒別診斷方法對豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的cDNA進行擴增均無特異性條帶，說明該方法特異性強。秦毅斌等[5]建立了檢測PEDV變異毒株的RTPCR方法結果顯示，建立的RT-PCR鑒別檢測方法能特異性區分疫苗株CV777和PEDV變異毒株，僅能擴增出PEDV變異毒株826 bp的目的片段，與豬傳染性胃腸炎病毒、A群豬輪狀病毒、豬嵴病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病病毒、豬瘟病毒及豬細小病毒均無交叉反應。敏感性試驗結果顯示，該方法能檢測到的最低核酸質量為11.3 pg。

3 套式PCR方法

套式PCR方法是設計內、外2對引物，通過2次擴增對樣品檢測，該法能節省時間和試劑用量，且敏感性較高。王金良等[6]根據已發表的PEDV N基因核苷酸序列，設計合成2對引物，建立了檢測PEDV的套式RT-PCR方法，其中外引物擴增片段長度為297 bp，內引物擴增片段長度為212 bp。鄧祖麗穎等[7]根據GenBank中PEDV基因組序列，設計并合成針對M基因的內、外2對特異性引物，通過優化反應條件，建立了檢測PEDV的巢式RT-PCR方法。結果顯示，該法對豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒及豬瘟病毒的擴增結果均為陰性。當使用外引物或內引物進行常規RT-PCR時檢測限量均為50 pg PEDV RNA模板，而使用巢式RT-PCR可檢測到50 fg PEDV RNA。劉琪等[8]根據GenBank中豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的基因序列分別設計兩對引物，在完成最佳條件篩選、特異性、敏感性試驗的基礎上，建立一種快速區分PEDV疫苗毒株與野毒株的巢式PCR檢測方法。建立的PCR快速檢測方法能分別對PEDV疫苗毒株和野毒株擴增出特異性片段，片段大小分別為774 bp和150 bp。該方法對TGEV、輪狀病毒（RV）、CSFV、PRV則不能擴增出特異性片段。

4 多重PCR方法

多重PCR是在常規PCR基礎上發展起來的，在同一PCR體系中，加入多對引物，同時檢測2種或多種病原核酸，它具有快速、靈敏度高、特異性強等優點廣泛用于各種臨床疾病的快速診斷。吳洋等[9]建立了可同時檢測PEDV、TGEV、RV的多重RTPCR方法，結果顯示，該方法可以同時擴增PEDV（682 bp）、TGEV（480 bp）和RV（297 bp）的特異性DNA片段，而對豬瘟病毒和豬偽狂犬病病毒的PCR擴增結果均為陰性，敏感性試驗結果表明，該多重RT-PCR方法對PEDV、TGEV和RV的最低檢出量分別為3.3×103拷貝/μL、3.2×103拷貝/μL、2.8×103拷貝/μL。賈銳等[10]根據GenBank中已登錄的TGEV、PEDV的序列，利用Primer 5.0計合成了2對特異性引物。用這2對引物對TGEV、PEDV cDNA模板首先進行單項PCR條件優化，然后采用正交試驗設計優化多重RT-PCR反應條件，結果同時擴增到2條與試驗設計相符的492 bp（PEDV）和211 bp（TGEV）特異性條帶，建立了能夠同時檢測2種病毒混合感染的特異、靈敏的多重PCR檢測方法，可檢測出約11 pg的PEDV和13 pg的TGEV。譚飛等[11]根據Gen－Bank中發表的CSFV和PEDV的基因組序列，設計篩選出兩對用于雙重RT-PCR反應的特異性引物，通過對特異性、靈敏性和穩定性等試驗，建立了檢測豬流行性腹瀉病毒和豬瘟病毒的雙重RT-PCR核酸檢測技術。利用建立的CSFV-PEDV雙重RTPCR核酸檢測技術，對某規模化豬場病料進行檢測，結果表明，擴增出約311 bp和501 bp大小的特異性條帶，為豬瘟與豬流行性腹瀉病毒混合感染。于新友等[12]根椐GenBank中登錄的PEDV、TGEV和豬A群輪狀病毒（PARV）基因序列，分別設計3對引物，在建立各病毒單項一步法RT-PCR技術的基礎上，優化多重RT-PCR反應條件，建立了3種病毒的一步法多重RT-PCR檢測方法，用這3對引物對同一樣品中的PEDV、TGEV和PARV核酸模板進行多重RT-PCR擴增，結果可同時擴增PEDV的450 bp、TGEV的609 bp、PARV的241 bp特異性片段，而對其它4種病原的擴增結果均為陰性。敏感性測定結果表明，該多重RT-PCR技術能檢出10pg的PEDV、10pg的TGEV和1 pg的PARV模板。任玉鵬等[13]根據GenBank中PEDV和TGEV基因序列保守區設計2對引物，參照文獻合成1對豬Delta冠狀病毒（PDCoV）引物，優化3對引物在同一RT-PCR擴增體系下的濃度、退火溫度等反應條件，同時優化方法的靈敏度、特異性。結果表明，建立的多重RT-PCR在引物量分別為PEDV 0.2 L，PDCoV 0.2 L和TGEV 0.4 L，退火溫度為53℃時的擴增效果最佳，最低檢測量分別為PEDV：60.96 pg、PDCoV：58.85 pg、TGEV：102.69 pg，用該法對多種豬傳染病病原DNA或cDNA進行擴增時均無非特異性擴增條帶出現。朱海俠等[14]根據GenBank中PED疫苗株與野毒株ORF3的特點設計特異性引物，建立能夠快速區分PEDV疫苗株與野毒株的RT-PCR檢測方法。建立的RT-PCR檢測方法能夠對PEDV疫苗株與野毒株擴增出特異性片段，其大小分別為278 bp和327 bp。該方法具有快速、特異、通用等特點，可用于實驗室快速診斷、野毒株的區分，為該病的診斷及免疫防控提供參考依據。

5 熒光定量PCR方法

熒光定量PCR技術是指采用熒光探針或SYBR GreenⅠ熒光染料通過連續監測熒光信號強弱的變化來測定特異性產物的量，不需要分離PCR產物，即能準確定量起始模板數。且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等優點。沈學懷等[15]建立了PEDV的SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR檢測方法，該法在1.21× 103～1.21×108拷貝/μL范圍內呈現良好的線性，相關系數R2為0.999，擴增效率為99%，擴增產物的熔解曲線為單個特異峰，產物Tm值為85.5～86℃，最低檢測限為1.21×101拷貝/μL。張志等[16]根據豬流行性腹瀉病毒N基因序列設計合成引物和探針，通過對熒光定量RT-PCR反應條件的優化，建立了TaqMan熒光定量RT-PCR檢測PEDV的方法。結果顯示，該方法的標準曲線的相關系數為0.99，檢測敏感性達到26.1拷貝/μL，且具有很好的特異性和重復性，對豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等檢測結果均為陰性，批內和批間變異系數均小于2.5%。董世娟等[17]建立檢測PEDV的TaqMan熒光定量PCR方法，并驗證其敏感性、特異性及重復性。結果表明：建立的定量標準曲線Ct值和模板起始拷貝數對數在108~11拷貝/μL有良好的線性關系，相關系數R2為0.997，該方法可檢測到初始模板中6.368拷貝/pL的質粒DNA，應用該方法檢測49份臨床樣品，陽性率達98%，比普通RT-PCR方法檢測的陽性率高18%。于長青等[18]用RT-PCR方法擴增PEDV的M基因片段，并克隆到PUC-T載體中，構建含有PEDV M基因片段的重組質粒。以系列稀釋后的重組質粒為模板，基于SYBR GreenⅠ進行PEDV檢測的實時熒光定量PCR擴增。結果顯示，擴增效率為100.4%，相鄰擴增曲線之間間距均勻，所有產物的熔解曲線具有單一整齊的峰，標準曲線具有優良的線性關系，最低可準確檢測520拷貝/μL的核酸模板，重復性試驗的變異系數小于3%。用所建立方法對3種常見豬源RNA病毒的檢測結果均為陰性，對臨床樣品的檢出率顯著（P< 0.05）高于常規PCR方法。曹貝貝等[19]根據GenBank中登錄的PEDV ZKHFQ株的N基因序列的保守區設計1對特異性引物，經過對反應條件進行優化，建立了檢測PEDV的SYBR GreenⅠ熒光定量RTPCR方法。該方法對常見的病毒均未檢測到熒光信號，而僅對PEDV檢測為陽性，其靈敏度為57拷貝/μL，組內和組間變異系數均小于1%。利用該方法對26份疑似PEDV感染的病料樣品進行檢測，結果顯示本研究所建立的方法對PED的檢出率比常規PCR高23.07%。勞秀杰等[20]根據GenBank報道的N基因高度保守核苷酸序列，設計并合成1對引物。上下游引物與GenBank中登錄的153株PEDV N基因全長序列匹配度分別是100%和97%。以本實驗室分離流行毒株為模板，利用SYBR GreenⅠ熒光染料法進行RT-PCR擴增，獲得擴增產物構建重組質粒作為陽性對照，建立檢測豬流行性腹瀉病毒核酸的方法。同一樣品進行3次重復試驗，變異系數<0.9%。通過對臨床樣品進行檢測和測序驗證，核酸檢測結果中的陽性樣品準確率為100%。

6 環介導等溫擴增技術

環介導恒溫擴增檢測方法（LAMP）是一種新興的分子生物學檢測方法，已廣泛應用于多種細菌病和病毒病的檢測。以操作簡單、檢測速度快、敏感性高、特異性好等優勢適合基層部門應用。鄭新添等[21]針對PEDV的NP基因設計LAMP引物，對反應體系優化并進行特異性及敏感性等試驗，建立了PEDV LAMP檢測方法，結果表明，該方法在65℃下恒溫擴增60 min，經SYBR GreenⅠ染色后僅肉眼觀察即可判定結果。該方法特異性好，與傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬瘟病毒及大腸桿菌等無交叉反應，對重組質粒最低檢測限度為16拷貝/μL。Yu等[22]建立了可視化檢測PEDV的RT-LAMP方法，該方法在62℃水浴條件下，45 min即可完成試驗反應，結果顯示，該法特異性好，對常見豬病毒的擴增結果均為陰性，其敏感性是一步法RT-PCR的100倍。Gou等[23]建立了PEDV的LAMP檢測方法，該方法在62℃水浴條件下，40 min即可完成反應，結果顯示，該法最低可檢測10 pg的RNA量，該法特異性好對常見豬病毒的擴增結果均為陰性，且不與其它常見豬病毒核酸發生交叉反應，特異性較好。時建立等[24]根據PEDV S基因設計特異性引物，通過優化各種反應條件，建立了檢測PEDV的LAMP快速檢測方法。此方法敏感度強，將反轉錄后的病毒cDNA稀釋到108倍仍可檢出，是PCR方法的100倍，該法特異性好，對其它病原的擴增結果均為陰性。

7 小結與展望

隨著分子生物學的發展，各國專家、學者先后建立了多種PEDV分子生物學檢測方法，但這些方法各有優缺點，如常規PCR方法、套式PCR方法和多重PCR方法雖然檢測簡單、快速、方便但不能精確定量，且敏感性有限，容易漏檢。熒光定量PCR技術彌補了常規PCR方法的缺點，但由于所用儀器和試劑價格昂貴，成本高，且對操作人員有很高的要求，不利于其在基層獸醫部門大規模推廣應用。LAMP方法是一種新興的方法，不需要特殊的儀器設備，操作簡便，更適合基層應用。單獨使用任何一種方法都很難正確診斷該病，做好將各種方法結合起來，綜合判斷，不同單位可根據自身的情況選擇適合的方法，相信隨著分子生物學的不斷發展，將會有更多的新型分子生物學診斷方法建立，從而為豬流行性腹瀉的診斷、分子流行病學調查和防控提供保障。

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（編輯：郭玉翠）

延緩衰老跑步最好

【德國《世界報》網站8月17日報道】題：這樣訓練最能保持年輕

端粒像保護罩一樣位于染色體的末端。隨著年齡增長，端粒變得越來越短并在某個時刻完全消失。這時染色體粘在一起，細胞死亡。專家稱，人們可以對這一過程多少施加些影響。

德國薩爾蘭大學醫學中心的心臟專科醫生克里斯蒂安·維爾納及其同事對哪種運動最有助于防止細胞老化進行了研究。他們將200多名年齡在30至60歲、從不做運動但也不吸煙、沒有血壓或心臟問題的成年人分成四組，其中三組分別進行耐力訓練、間歇運動訓練與力量訓練。另外一組則保持不運動的狀態，以便進行比較。

結果發現，三種訓練都達到了穩定端粒的效果，所有從事運動的人的端粒數量都多于不運動的人。但是只有跑步激活了端粒酶。這種酶存在于人體細胞內，并負責生成端粒。維爾納說，不管參加者是進行了間歇跑訓練還是繞著跑道跑圈，端粒酶在細胞內的活動都增加至兩倍。這不僅對端粒有益，總體來說也對細胞有好處。

他說：“適度和定期的耐力訓練能遏制血管細胞的老化并降低患心血管疾病的風險。訓練令心臟和血管的抗壓能力提高。”

雖然人們無法將心臟訓練得更年輕，卻可以令其保持年輕。因此在50歲時開始跑步也是值得的。“在最理想的情況下，到80歲時你還可以擁有50多歲的人的心臟。”

對力量訓練愛好者來說也有令人欣慰的消息：器械訓練也強化了端粒，只不過是以另外的方式，而且效果沒有跑步好。

美國近期的一項研究顯示，力量訓練也能延長壽命。賓夕法尼亞州立大學的珍妮佛·克瓦什涅夫斯基，將針對退休人員進行的一次大規模健康調查的數據與死亡登記的數據進行了比較。

有3萬多名65歲以上的人接受了調查，回答的問題包括他們是否像醫生建議的那樣進行了肌肉訓練，因為這可以預防骨折和其他老年問題。調查顯示，其中9%的老年人每周進行兩次力量訓練。

研究者將從事力量訓練者與其他老年人的死亡風險進行比較，發現前者的死亡風險低了近一半。當然，運動的老年人過胖、吸煙、喝酒的也少，進行耐力訓練的也更多。

具體到每個人，很難說其中哪個因素延長了壽命。但即便如此，力量訓練仍被證明是有益的，死亡風險降低了。

“任何訓練都好過沒有訓練。”維爾納說。最好是為了保護心臟進行耐力運動，并且為了強健肌肉和增加骨密度而進行力量訓練。

不管怎么說，在拖延運動時想想染色體，或許會對你有所幫助—至少端粒肯定是會高興的。

（轉自參考消息[N]，2016-08-19）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)05-0081-04

2016-08-29

山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目（SDAIT-08-17）；山東省重點研發計劃項目（2015GSF121027）

李天芝（1985-），女，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動物傳染病診斷技術研究.E-mail：517493935@qq.com