久瀉寧顆粒治療大鼠慢性非特異性潰瘍性結腸炎的實驗研究*

馬少丹，趙紅霞，程遠棚，苑述剛，邱美榕，阮時寶

(1.福建中醫藥大學藥學院，福州 350122;2.中國中醫科學研究院中醫基礎理論研究所，北京 100700)

久瀉寧顆粒治療大鼠慢性非特異性潰瘍性結腸炎的實驗研究*

馬少丹1，趙紅霞2△，程遠棚1，苑述剛1，邱美榕1，阮時寶1

(1.福建中醫藥大學藥學院，福州 350122;2.中國中醫科學研究院中醫基礎理論研究所，北京 100700)

目的:研究久瀉寧顆粒對慢性潰瘍性結腸炎(UC)的治療作用并探討其可能的作用機制。方法:以2，4-二硝基氯苯和異種異體抗原乳化液聯合應用建立大鼠潰瘍性結腸炎模型后，連續給藥14 d，腹主動脈采血測定血清 IL-2、TNF-α、免疫球蛋白IgG、IgM以及SOD、MDA，同時截取結腸潰瘍明顯處做病理分析。結果:UC模型組與正常組比較差異有統計學意義，血清TNF-α、IgG、IgM水平明顯升高，IL-2水平明顯降低。與模型組比較，久瀉寧顆粒組TNF-α、IgG、IgM、MDA水平降低，IL-2、SOD水平升高。結論:久瀉寧顆粒能明顯調節UC大鼠機體免疫功能異常，對UC模型大鼠結腸潰瘍面有較好的修復作用。

久瀉寧顆粒;潰瘍性結腸炎;異種異體免疫;藥效

潰瘍性結腸炎(UC)是一種病因尚不明確的直腸和結腸慢性非特異性炎癥性疾病。其病程持續緩慢發展，發病期和緩解期交替發作，癥狀時好時壞，部分患者甚至持續加重［1］，可發生于任何年齡［2］。UC目前尚無徹底根治的方法且復發率高，臨床治療以緩解癥狀為主。多數專家認為，免疫因素在潰瘍性結腸炎的病因中發揮著重要作用，因此可通過調節腸黏膜免疫功能達到治療目的。

久瀉寧顆粒的配方是原福建中醫學院院長、全國著名中醫藥專家俞長榮教授治療慢性泄瀉的經驗方，由參苓白術散與痛瀉要方以健脾滲濕、調氣止瀉為治法化裁而來，臨床治療潰瘍性結腸炎屬于脾虛氣滯濕阻證見久瀉不愈者療效頗佳。本實驗通過異體免疫致大鼠慢性潰瘍性結腸炎模型試驗，研究久瀉寧顆粒治療慢性潰瘍性結腸炎的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

多功能酶標儀 INFINITE M200Pro(TECAN公司);RE-52旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠); TDL-4型低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠); DHG-9240型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);85-2磁力攪拌器(常州國華電器有限公司);小型臺式離心機(Eppendorf centrifuge5418);DZF數顯真空干燥箱(鄭州長城科工貿有限公司)。

1.2 藥品與試劑

久瀉寧顆粒(自行制備);補脾益腸丸(廣州陳李濟藥廠有限公司提供，批號 FJ243);柳氮磺胺吡啶片(上海信誼嘉華藥業有限公司，批號H31020557);2，4-二硝基氯苯(天津市光復精細化工研究所，批號20081028);β-環糊精(簡稱 β-CD，國藥集團化學試劑有限公司，批號69009360);弗氏完全佐劑(美國Sigma公司，批號 CAS 9007-81-2);總蛋白試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號lot 20T00150);SOD(批號20130724)、MDA (批號20130726)、IgG(批號20130702B)、IgM(批號20130702B)、TNF-α(批號20130702B)、IL-2(批號20130702B)均為南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗動物

清潔級SD大鼠雌雄各半，體質量(200±20)g，上海斯萊克實驗動物有限公司提供(許可證號SCXK(滬)2012-0002)。實驗動物在福建中醫藥大學動物飼養中心飼養和管理(環境設施合格證書SYXK(閩)2009-0001)。

1.4 藥物與制備

1.4.1 受試藥物 久瀉寧顆粒嚴格按照制備工藝制作，實驗用藥為顆粒劑成型前的濃縮液。方中黨參、白術等藥材購自福建中醫藥大學國醫堂中藥房，經藥學院車蘇容副教授鑒定，符合 2010版《中國藥典》各藥材項下標準。

1.4.2 藥物制備 取黨參、野麻草、荷葉等6味藥材加入8倍量水浸泡60 min，煎煮3次，每次煎煮1 h，合并 3次提取液過濾，濾液濃縮后水提醇沉［3］。取砂仁、白術等 3味藥材加 5倍水煎煮 7 h［4］，水提醇沉后濃縮，揮發油包合［5］，并按照工藝要求制成顆粒劑成型前的濃縮液。

1.5 實驗方法

1.5.1 實驗動物分組 清潔級SD大鼠70只，雌雄各半，體質量(200±20)g，分層按隨機數字表法分為空白對照組、UC模型對照組、UC模型+補脾益腸丸或柳氮磺胺吡啶片陽性對照組、UC模型+久瀉寧顆粒高劑量組、中劑量組和低劑量組7組各10只。

1.5.2 模型制備 ①造模所需異種異體抗原及灌腸液的制備:異種異體抗原按照本課題組方法［6］稍作改進，取家兔新鮮結腸黏膜組織，以 PBS為介質充分勻漿后，－20℃條件下冷凍24 h后取出溶凍，并以4000 r/min速度離心30 min，取上清液用總蛋白試劑盒雙縮脲法測定蛋白質含量。抗原乳化液:異種異體抗原與弗氏完全佐劑等體積配比。灌腸液:2，4-二硝基氯苯與無水乙醇等體積配比，濃度為2.5%(w/v);②異體免疫誘發法模型制備［7］:在大鼠左側前后足趾皮下注射抗原乳化液，使大鼠獲得8 mg異種蛋白。14 d后，在大鼠腹股溝部位皮下注射抗原乳化液，同樣使大鼠獲得8 mg異種蛋白。大鼠免疫刺激40 d后，用硅膠管插入大鼠肛門深約8 cm，局部灌腸1 mL灌腸液。拔出硅膠管后迅速捏緊大鼠肛門8 min，其間不斷搖擺大鼠使灌腸液在腸道中分布均勻。待灌腸液不再從肛門流出，把大鼠放回籠中常規飼養。

1.5.3 給藥方法 正常組和 UC模型對照組給予等量生理鹽水，各給藥組分別給予久瀉寧顆粒高劑量26.8 g/kg、中劑量13.4 g/kg(相當于60 kg人的等效劑量147 g/d)、低劑量6.7g/kg(以上濃度均為生藥含量)。補脾益腸丸1.65 g/kg(相當于60 kg人的等效劑量)、柳氮磺胺吡啶片組 0.25 g/kg (相當于60 kg人的等效劑量)，每天1次，連續灌胃14 d。

1.5.4 標本采集及處理 大鼠灌胃給藥第14天后，禁食不禁水24 h，第21天用10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血以3000 r/min離心10 min，分離血清，冰凍保存待測。取大鼠結腸平鋪于冰塊上進行大體形態學損傷評分，取結腸潰瘍明顯處做病理分析。

1.5.5 檢測指標與方法 白介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、免疫球蛋白 IgG、IgM測定采用ELISA法，總超氧化物歧化酶(T-SOD)測定采用羥胺法，丙二醛(MDA)測定采用TBA法，總蛋白測定采用雙縮脲法。

1.5.6 UC大鼠結腸大體形態學損傷評定標準［8］大鼠結腸大體形態學損傷按照程度輕重進行評分:若無潰瘍、無炎癥為0分;若無潰瘍但局部充血為1分;若潰瘍形成且不伴充血為2分;有1處潰瘍伴炎癥為3分;多處潰瘍伴炎癥為4分;若潰瘍超過2 cm為5分;若潰瘍超過2 cm且病變每超過1 cm加1分則為6～10分。

1.5.7 統計學方法 采用統計軟件進行統計分析，結果以均數±標準差(±s)表示。

2 結果

2.1 久瀉寧顆粒對 UC模型大鼠檢測指標的影響

表1顯示，UC模型組與正常對照組比較，IL-2、SOD降低與TNF-α、IgG、IgM、MDA、損傷指數升高，差異有統計學意義(P＜0.01)。與 UC模型組比較，中藥對照組可明顯升高IL-2，降低MDA水平，差異有統計學意義(P＜0.01);可降低 TNF-α、損傷指數，差異有統計學意義(P＜0.05);西藥對照組可明顯升高IL-2、SOD，降低TNF-α、IgG、MDA、損傷指數水平，差異有統計學意義(P＜0.01);可降低IgM水平，差異有統計學意義(P＜0.05);久瀉寧顆粒中劑量組可明顯升高IL-2、SOD，降低MDA、損傷指數水平，差異有統計學意義(P＜0.01);可降低 IgG、IgM水平，差異有統計學意義(P＜0.05);久瀉寧顆粒高劑量組可明顯降低MDA水平差異有統計學意義(P＜0.01)，可升高IL-2，降低TNF-α，損傷指數差異有統計學意義(P＜0.05)。與陽性對照組比較，久瀉寧高劑量組可明顯降低MDA水平，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1 久瀉寧顆粒對UC模型大鼠檢測指標的影響(±s)

表1 久瀉寧顆粒對UC模型大鼠檢測指標的影響(±s)

注:a與空白對照組比較:#P＜0.01，##P＜0.05;b與 UC模型組比較:*P＜0.01，＊＊P＜0.05;c與中藥對照組比較:ΔP＜0.01，ΔΔP＜0.05;d與西藥對照組比較:☆P＜0.01，☆☆P＜0.05

組 別 鼠數 劑量(g/kg) IL-2(pg/mL) TNF-α(pg/mL) IgG(mg/mL) IgM(mg/mL) SOD(U/mg) MDA(nmol/mL)損傷指數正常對照組 10 10.58±0.62 7.79±0.98 16.83±1.08 10.23±0.70 98.58± 3.32 5.55±0.13 0 UC模型組 9 8.89±0.73# 9.05±1.13# 18.60±1.05# 12.13±1.38# 78.24± 2.74# 6.60±0.21# 3.56±1.13#中藥對照組 8 1.65 9.73±0.43#* 8.15±0.55＊＊ 17.39±0.83＊＊ 10.95±0.52 79.12±15.08## 5.02±0.42#* 2.63±0.74#＊＊西藥對照組 9 0.25 10.23±0.65* 7.97±0.31* 16.91±0.80* 10.78±0.59＊＊ 92.94± 4.78#* 4.47±0.14#* 2.33±0.87#*低 劑 量 組 8 6.70 9.25±0.83# 8.61±0.68## 18.17±0.86# 11.10±0.90## 79.97± 3.73# 6.43±0.16# 3.11±0.78#中 劑 量 組 9 13.40 9.62±0.84* 8.38±0.83 17.45±1.31＊＊ 10.59±0.62＊＊ 91.38± 3.54##* 4.72±0.38#* 2.11±0.93#*高 劑 量 組 9 26.80 9.34±0.74＊＊ 8.21±0.68＊＊ 17.69±0.69 10.99±0.50 81.60± 3.52# 5.35±0.28##*ΔΔ☆☆2.50±0.93#＊＊

2.2 久瀉寧顆粒對UC模型大鼠結腸組織的影響

光鏡下病理切片觀察，正常對照組大鼠結腸黏膜上皮完整，腺體排列規則，結構清楚;UC模型組大鼠結腸黏膜脫落，潰瘍面積大，潰瘍點較多;陽性對照組均可見一層上皮組織蓋住潰瘍;久瀉寧低劑量組可見兩邊上皮組織向中間愈合趨勢;久瀉寧中劑量組上皮組織基本完整，腺體排列欠規則，潰瘍大部分基本愈合;久瀉寧高劑量組上皮組織基本完整，腺體排列較規則，潰瘍大部分基本愈合。

3 討論

中醫學尚無結腸炎病名，根據其臨床證候特點屬于“泄瀉”“痢疾”等范疇，《黃帝內經》中就有關于洞泄、飧泄等記載。中華中醫藥學會在《中醫內科常見病診療指南·西醫疾病部分》中，將本病分為大腸濕熱、脾氣虛弱、脾腎陽虛、肝郁脾虛、寒熱錯雜、熱毒熾盛6個證型［9］。脾虛濕盛是形成本病的重要病機，故益氣健脾、除濕止瀉為本病的常見治法之一。

本實驗采用異體免疫誘發法制備動物模型，因多數專家認為免疫因素在潰瘍性結腸炎的致病因素中發揮著重要作用，潰瘍性結腸炎的臨床和病理表現均可觀察到腸黏膜的免疫功能異常。近年來，以免疫方法制備潰瘍性結腸炎動物模型亦被多數專家認可。由于大鼠對局部免疫損傷有較強的修復能力，單純的體液或細胞免疫反應異常不足以反映人類UC的病變過程。本實驗免疫誘導法所致的潰瘍性結腸炎動物模型，采用異種異體結腸黏膜組織致敏法，并加局部刺激造模。實驗中模型組大鼠的血清IL-2、TNF-α、免疫球蛋白 IgG、IgM以及 SOD、MDA等免疫和炎癥指標較正常組都發生明顯變化，說明造模成功。

IL-2主要由CD4+T1細胞產生，可引起T細胞的增殖分化，而T細胞的活化又可抑制整個特異性免疫應答［10］。經免疫法導致大鼠潰瘍性結腸炎的研究發現［11］，UC大鼠模型組血清中 IL-2活性明顯低于空白對照組，治療后血清中IL-2活性升高。本實驗研究數據亦證明了這一點。

腫瘤壞死因子(TNF)能殺傷和抑制腫瘤細胞，參與某些自身免疫病的病理損傷，同時又是腸道上皮細胞增殖和凋亡的重要調節因子［12-13］。久瀉寧顆粒可抑制TNF-α的產生，從而減少特異性或非特異性炎癥分子的釋放，緩解腸道免疫破壞作用。

在胃腸道疾病中，當免疫復合物IgG大量增多或沉淀在有病損器官中時，會給機體帶來不良影響，造成局部腸黏膜損傷，同時潰瘍性結腸炎患者在腸黏膜受到炎癥侵犯時產生IgM。實驗大鼠經久瀉寧顆粒治療后，其血清IgG和IgM明顯下降，提示久瀉寧顆粒可改善機體體液免疫功能，減輕腸道組織損傷，緩解UC癥狀。

氧自由基是促進炎癥發生發展的重要因素，在UC模型中，腸組織中的MDA、損傷指數及在TNBS/乙醇灌腸后與對照組比較均有明顯升高，腸組織中的SOD明顯下降［14］。本實驗數據顯示，久瀉寧顆粒可明顯降低MDA水平，升高SOD水平。

從藥效學實驗數據可以看出，久瀉寧顆粒中劑量組的總體療效較高、低劑量組要好，說明藥物劑量與療效的關系一般不是簡單的正比關系，而是類似拋物線的關系，劑量過小沒有療效，劑量過大反而起抑制作用，這為臨床用藥劑量的確定提供了客觀實驗依據。

本實驗從調節機體免疫功能著手，研究久瀉寧顆粒治療潰瘍性結腸炎的作用機理，發現久瀉寧顆粒對UC模型大鼠免疫功能的異常可從多環節進行調節。但本文僅從整體的免疫學水平進行觀察，有待于今后從血清藥理及分子水平作進一步的研究。

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R285.5

:B

:1006-3250(2016)03-0355-03

2015-07-10

福建省科技廳社會發展重點項目(2012Y0040)

馬少丹(1974-)，女，副教授，醫學博士，碩士研究生導師，從事方劑配伍與臨床運用研究。

△通訊作者:趙紅霞(1970-)，女，副研究員，醫學碩士，從事中醫基礎理論、方劑學及疑難病臨床與研究，Tel:64089033，E-mail:zhaohongxia7000@163.com。