扶腎降濁方對系膜增生性腎炎大鼠腎小管間質損害的保護作用*

蘇瑋蓮，李國霞，寧志芬，李春雨，李經秀，魏曉露

(1.天津中醫藥大學，天津 300193;2.天津醫科大學，天津 300070)

扶腎降濁方對系膜增生性腎炎大鼠腎小管間質損害的保護作用*

蘇瑋蓮1，2，李國霞2△，寧志芬2，李春雨2，李經秀2，魏曉露2

(1.天津中醫藥大學，天津 300193;2.天津醫科大學，天津 300070)

目的:觀察扶腎降濁方對系膜增生性腎炎大鼠腎小管間質損害的保護作用。方法:采用系膜增生性腎炎模型，將大鼠按隨機數字表法分為正常組、模型組、扶腎降濁方組、貝那普利組。分別觀察實驗16周和20周末扶腎降濁方對系膜增生性腎炎大鼠的腎功能、腎組織病理變化的影響，并設貝那普利為陽性對照組。結果:16周和20周末模型組及用藥組大鼠血液肌酐、尿素氮、β2-微球蛋白和24 h尿蛋白均明顯高于正常組，中藥組、貝那普利組均較模型組明顯降低;模型組腎小管損害明顯，腎間質纖維化顯著，且隨造模時間延長病變程度逐漸加重，中藥組和貝那普利組腎小管損害較輕，腎間質局灶性纖維化。結論:扶腎降濁方能改善系膜增生性腎炎大鼠腎功能，減輕腎小管間質損害，具有腎臟保護作用。

系膜增生性腎炎;腎小管間質損害;扶腎降濁法;保護作用

系膜增生性腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)是常見的原發性腎小球疾病的病理類型。腎小管間質損害是腎小球腎炎由炎癥的啟動進展至腎臟纖維化的中間環節，腎小球腎炎進展至腎臟纖維化大多已不可逆轉，而對其中間環節即腎小管間質損害進行早期有效的干預，則可能大大改善腎小球腎炎進展至腎功能衰竭的預后。本文采用MsPGN模型，延長造模時間至20周，使之逐漸發展成腎小管間質損害，以探討扶腎降濁方對系膜增生性腎炎腎小管間質損害的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雄性Wistar大鼠48只，體質量(150±10) g，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所(實驗動物許可證號 SCXK-(軍)2009-003)。

1.2 藥物與試劑

葡萄球菌腸毒素B(由軍事醫學科學院微生物流行病研究所提供，批號121101)，完全弗氏佐劑(批號 SLBC5083)和不完全弗氏佐劑 (批號SLBB9817)均購自美國 Sigma公司，牛血清白蛋白(天津潤泰科技發展有限公司，AMRESCO分裝，批號201410)，Masson染液(南京建成科技有限公司，批號20131018)，伊紅染液(南京凱基生物科技發展有限公司產品，批號KGA231)，蘇木素染液(南京凱基生物科技發展有限公司產品，批號 KGA223)，中藥扶腎降濁方由山茱萸、生黃芪、白花蛇舌草、丹參、鬼箭羽、益母草組成，天津中醫藥大學中藥學院提供，按比例稱取后水煎提取經濃縮干燥制成粉末，每克粉末含生藥4.06 g(批號20120810)。西藥鹽酸貝那普利片(北京諾華制藥有限公司，批號X1801)。

1.3 主要儀器

全自動生化分析儀，東芝 TBA-120(日本東芝TOSHIBA公司);自動脫水機Leica ASP200、包埋機Leica EG1150、切片機Leica RM2245(LEICA公司);奧林巴斯BX51顯微鏡成像系統(奧林巴斯公司);日本日立HT7700透射電鏡。

1.4 方法

1.4.1 動物模型的建立及分組 健康雄性Wistar大鼠經普通飼料適應性飼養1周后，尿蛋白、紅細胞均陰性，按隨機數字表法分為正常組、模型組、扶腎降濁方組、西藥貝那普利組各12只。系膜增生性腎炎模型造模方法參照劉震［1］等報道的方法加以改進。實驗第1天起模型組、中藥組、西藥組以牛血清白蛋白20 mg配成水溶液，隔日灌胃1次，正常組以等量生理鹽水隔日灌胃，直至實驗結束;實驗第1天模型組、中藥組、西藥組經皮下分點注射完全弗氏佐劑0.2ml，第8天注射不完全弗氏佐劑0.2 ml，第8天及第15天尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素B (0.4 mg/kg體質量)各1次，均造模成功;正常組以等量生理鹽水注射。

1.4.2 給藥方法 治療組自造模第1天開始給藥，中藥組以中藥煎劑灌胃(51.5 g·kg－1/d)，西藥組以鹽酸貝那普利灌服(4 mg·kg－1/d)，模型組及正常組以等量生理鹽水灌胃。實驗期間，各組動物自由飲食、飲水，分別于造模第16、20周末處死動物。

1.4.3 24 h尿蛋白定量 檢測16周、20周末各組大鼠24 h尿蛋白，將每只大鼠分別置于大鼠代謝籠中，留尿期間禁食，自由飲水，記錄24 h尿量，用日本東芝 TBA-120全自動生化分析儀檢測尿蛋白濃度，并計算24 h尿蛋白定量。

1.4.4 血液生化指標檢測 分別于造模第16、20周末處死大鼠，腹主動脈取血，日本東芝TBA-120全自動生化分析儀分別檢測血清中尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(serum creatinine，Scr)、β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)。

1.4.5 腎組織形態學觀察 分別于造模第16、20周末處死大鼠，迅速打開腹腔，將取出的兩腎組織各取大小不等的兩部分，一部分腎組織用4%多聚甲醛溶液固定，進行石蠟包埋切片，切片厚度為4μm，將組織切片按常規方法進行 HE、Masson染色。另一部分腎組織用2.5%戊二醛溶液固定，并按常規方法進行透射電鏡觀察。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，以均數±標準差(±s)表示，根據方差齊性結果選擇單因素方差分析法進行組間比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血液生化指標檢測結果

表1、2顯示，造模16周和20周末，模型組和用藥組BUN、Scr、β2-MG均比正常組大鼠增高，模型組增高明顯，差異有統計學意義(P＜0.01)。隨著造模時間延長，各指標值逐漸增高，腎功能逐漸損害。經中藥和西藥治療后，大鼠BUN、Scr、β2-MG值均較模型組明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.01)，中西藥比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠腎功能檢測結果(±s)

表1 各組大鼠腎功能檢測結果(±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:##P＜0.01

組別 鼠數 BUN(mmol/L)Scr(μmol/L) 16周 20周 16周 20周6.56±0.55 7.05±0.44 27.80±1.04 26.66±2.54模 型 組 6 11.46±0.88＊＊ 13.00±1.30＊＊ 47.25±8.80＊＊ 55.23±5.15＊＊扶 腎 降 濁 方 組 6 8.36±0.49＊＊## 9.17±0.58＊＊## 35.63±4.05＊＊## 40.98±2.21＊＊##貝 那 普 利 組 6 8.23±0.36＊＊## 8.99±0.80＊＊## 29.96±3.09＊＊## 38.48±4.45＊＊##正常組6

表2 各組大鼠β2-MG檢測結果(mg/L，±s)

表2 各組大鼠β2-MG檢測結果(mg/L，±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:##P＜0.01

組別 鼠數 16周 20周6 0.28±0.12 0.56±0.10模 型 組 6 0.87±0.10＊＊ 1.04±0.26＊＊扶腎降濁方組 6 0.64±0.17＊＊## 0.98±0.32＊＊##貝 那 普 利 組 6 0.61±0.06＊＊## 0.92±0.14＊＊##正常組

2.2 各組大鼠24 h尿蛋白定量結果

表3顯示，造模16、20周末，模型組大鼠 24 h尿蛋白定量明顯升高，與正常組比較差異有統計學意義(P＜0.01)，中藥組和西藥組較模型組降低，差異有統計學意義(P＜0.01)，尿蛋白定量隨著造模時間延長顯著增高;中西藥比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.3 腎臟病理學變化

圖1～3顯示，普通光鏡下可見正常組腎小球和腎小管結構清晰，腎小管上皮細胞排列整齊，未發現變性和壞死，間質無纖維化及炎細胞浸潤。第16周末，模型組腎小管上皮細胞出現腫脹、顆粒變性、壞死，部分小管完全萎縮。Masson染色顯示，有間質纖維化伴炎細胞浸潤;中藥組和西藥組小管輕度變性、壞死，間質有少量纖維組織增生，同時伴炎細胞浸潤。第20周末，模型組小管變性、壞死程度進一步加重。Masson染色顯示，腎小球和腎間質有大量纖維組織增生及大量炎細胞浸潤，中藥組和西藥組小管變性較模型組輕，間質有局灶性纖維化及較多的炎細胞浸潤。

表3 各組大鼠24 h尿蛋白檢測結果(mg/dl，±s)

表3 各組大鼠24 h尿蛋白檢測結果(mg/dl，±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:##P＜0.01

組別 鼠數 16周 20周6 8.22± 2.28 9.14± 2.97模 型 組 6 82.56±30.50＊＊ 106.43±14.35＊＊扶腎降濁方組 6 46.76± 7.85＊＊## 70.00± 7.07＊＊##貝 那 普 利 組 6 44.56± 6.82＊＊## 71.89±10.76＊＊##正常組

圖1 16周末各組腎組織HE染色病理圖片(HE staining ×200)

圖2 20周末各組腎組織HE染色病理圖片(HE staining ×200)

圖3 20周末各組腎組織Masson染色病理圖片(Masson staining，×200)

圖4 顯示，透射電鏡觀察可見正常組腎小管上皮細胞排列整齊，基底膜厚度正常，足突排列整齊，線粒體清晰，結構完整。第16、20周末模型組腎小管上皮細胞基底皺褶擴張，基底膜結構不完整，增厚明顯，腎小球系膜細胞增多，系膜基質增多，腎間質基質和膠原纖維增多，線粒體腫脹破壞，大量溶酶體出現。中藥組和西藥組小鼠腎小球基底膜輕度增厚，足突融合現象不明顯，腎小球系膜細胞少量增多，腎間質基質輕度增多。隨著造模時間的延長，腎小管間質損害程度逐漸加重。

圖4 20周末各組腎組織透射電鏡病理圖片

3 討論

由慢性腎小管間質損害導致的腎間質纖維化病變已成為幾乎所有腎臟疾病的共同最終結局［2］。系膜增生性腎小球腎炎以彌漫性腎小球系膜細胞增生和不同程度系膜基質增多為主要病理特征。當腎小球系膜病變較輕時，腎間質和腎小管基本正常，但是在腎小球系膜病變嚴重時，腎間質即可出現炎細胞浸潤及纖維化，伴腎小管萎縮［3］。由此可見，腎小管間質損害系腎小球腎炎進展至腎臟纖維化的關鍵環節，早期防治腎小管間質損害對于防止腎小球腎炎進展惡化有重要作用。現代醫學對腎小管間質損害的防治尚無特效療法，而中醫藥在逆轉腎小管間質損害、延緩慢性腎功能衰竭進展方面具有較好的臨床療效。李國霞［4］等研究表明，中醫藥對腎小管間質損害大鼠腎臟具有一定的保護作用，因此研究及開發中醫藥對腎小管間質損害的防治作用具有較高的價值。

根據中醫理論，慢性腎小球腎炎發展到腎小管間質損害階段，脾腎兩虛(尤其是腎虛)是其發病的內在因素，濕熱瘀濁是其遷延不愈的病理基礎［5］。本研究前期工作表明，扶腎降濁方可抑制COLⅠ和COLⅢ在腎臟的積聚以減輕腎間質纖維化［6］。故本研究采用扶腎降濁方治療系膜增生性腎炎腎小管間質損害，探究其保護作用機理。研究結果顯示，造模16和20周末，大鼠血清肌酐和尿素氮水平升高，24 h尿蛋白定量增高，提示腎功能受損。血中 β2-MG幾乎完全從腎小球濾過，濾過的β2-MG 99.9%被近曲小管上皮細胞吸收并分解代謝。因此，正常人尿液中含量甚微，當近曲小管受損時，尿液中 β2-MG含量就會增加。造模后大鼠β2-MG增高，提示腎小管受損。病理形態結果顯示，模型組腎小管上皮細胞出現腫脹、顆粒變性、壞死，個別小管完全萎縮，間質局部纖維化，且隨著造模時間延長，腎小球和腎小管結構進一步破壞，小管變性、壞死程度加重，腎小球和間質有大量纖維組織增生及炎細胞浸潤。中藥組和貝那普利組大鼠血清肌酐、尿素氮、β2-MG和24 h尿蛋白均降低，腎功能明顯改善，較之模型組腎小管變性和間質纖維化程度皆較輕。結果表明，扶腎降濁方可明顯改善患病大鼠腎功能，減輕腎臟病理改變，保護腎臟。

扶腎降濁方由山茱萸、生黃芪、白花蛇舌草、丹參、鬼箭羽、益母草6味中藥組成，山茱萸益肝腎之陰，斂精固澀;生黃芪補肺脾之氣，二藥相伍，使滋陰不至于呆膩，補氣不過于溫燥以扶腎固本;白花蛇舌草清熱利濕解毒;丹參、鬼箭羽、益母草活血化瘀，利水消腫，清除體內久蘊之濕熱、瘀濁等病理產物，恢復機體的正常代謝功能以治標。諸藥合用，標本兼治，既有整體調節又有對因治療，從而達到控制疾病進展的目的。

［1］劉震，周樹錄，譚建三，等.大鼠系膜增殖型腎小球腎炎模型的改進［J］.華西醫科大學學報，1996，27(2):182-184.

［2］Reilly RF，Bulger RE，Kriz W.Structrue-function relationships in the kidnety//Schirier RW.Diseases of the kidney and Urinary tract.8th ed［M］.Philadelphia:Lippincott William＆Wilkins，2007:2-53.

［3］王海燕.腎臟病學［M］.3版.北京:人民衛生出版社，2012: 1016-1023.

［4］李國霞.系膜增生性腎炎大鼠腎小管間質損害的相關因素及疏利少陽法之腎疏寧作用機理的研究［D］.天津:天津中醫學院，2005:1-153.

［5］李國霞，黃文政.系膜增生性腎炎腎小管間質損害的中醫病因病機探討［J］.江蘇中醫藥，2008，40(4):12-13.

［6］蘇瑋蓮，李春雨，李國霞，等.扶腎降濁方對系膜增生性腎炎腎小管間質損害大鼠COLⅠ及COLⅢ蛋白和基因表達的影響［J］.上海中醫藥雜志，2014，48(12):80-84.

Protective Effect of Fushen Jiangzhuo Decoction on the Renal Tubular Interstitial Damage in Rats with Mesangial Proliferative Glomerulonephritis

SU Wei-lian1，2，LI Guo-xia2△，Ning Zhi-fen2，LI Chun-yu2，LI Jing-xiu2，WEI Xiao-lu2
(1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicice，Tiaojin 300193，China; 2.Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China)

Objective:To observed the effect of“supporting kidney to eliminate turbid fluid”prescription on protection of tubulointerstitial injury in rats with mesangial proliferative glomerulonephritis.Methods:Using mesangial proliferative glomerulonephritis model，rats were randomly divided into normal group，model group，TCM group and western medicine group.Experiments were observed for 16weeks and 20weeks of effect of TCM which can support kidney to eliminate turbid fluid on protection of tubulointerstitial injury in rats with mesangial proliferative glomerulonephritis，and set benazepril served as positive controls.Results After making model for 16weeks，20weeks，the rats blood creatinine，urea nitrogen，β2-MG and 24-hour urine protein of model group and TCM group were significantly higher than normal group，compared with the model group，TCM group and benazepril group were decreased significantly;Tubular damage，renal interstitial fibrosis were obviously observed on model group and increased with age，TCM group and benazepril group had less tubular damage，renal interstitial focal fibrosis.Conclusion:TCM which can support kidney to eliminate turbid fluid can improve the kidney function of the rats with mesangial proliferative glomerulonephritis，decrease the tubulointerstitial injury and protect the kidney.

Mesangial proliferative glomerulonephritis;Tubulointerstitial lesions;Supporting Kidney to Eliminate Turbid Fluid;Effect of protection

R285.5

:B

:1006-3250(2016)03-0342-03

2015-02-09

天津市自然科學基金資助項目(11JCYBJC12800)-扶腎降濁法調控纖維化因子保護腎小管間質損害的機理

蘇瑋蓮(1981-)，女，廣西人，講師，醫學碩士，從事中醫藥治療腎病的機制研究。

△通訊作者:李國霞(1967-)，女(滿族)，河北人，教授，醫學博士，從事中醫藥治療腎病的機制研究，Tel:022-83336911，E-mail:liguoxia96@126.com。