旱蓮草對老年癡呆模型大鼠學習記憶及海馬神經遞質的影響*

王愛梅，耿若君，李 弋，陳亞奇，未小明，張 珊，張 廷

(南陽醫學高等專科學校，河南 南陽 473061)

旱蓮草對老年癡呆模型大鼠學習記憶及海馬神經遞質的影響*

王愛梅，耿若君，李 弋，陳亞奇，未小明，張 珊，張 廷

(南陽醫學高等專科學校，河南 南陽 473061)

目的:觀察旱蓮草對老年癡呆模型大鼠學習記憶能力及海馬神經遞質的影響。方法:健康成年SD大鼠按隨機數字表法分為對照組、模型組、藥物低、高劑量組。皮下注射D-半乳糖聯合雙側海馬注射Aβ25-35構建老年癡呆大鼠模型，各組給予相應藥物灌胃治療8周。用藥結束后，觀察各組大鼠學習記憶能力、海馬神經元形態變化及海馬中NE、DA、5-HT的含量和ChAT、AChE的酶學活性。結果:與模型組比較，藥物高劑量組潛伏期延長，錯誤次數降低;海馬中錐體細胞形態結構基本正常，細胞脫失現象較少;NE、DA和5-HT含量增高，ChAT活性升高，AChE活性降低。結論:旱蓮草可改善老年癡呆模型大鼠學習記憶功能，其機制可能與改善海馬神經元形態結構、減少神經元細胞丟失、改善海馬中神經遞質的代謝有關。

旱蓮草;老年癡呆;學習記憶;NE;DA;5-HT;ChAT;AChE

老年性癡呆又稱阿爾茨海默病 (alzheimer’s disease，AD)，以記憶力減退、認知功能障礙為特征，目前尚無滿意的治療藥物。單胺類神經遞質和膽堿能神經遞質是腦內的重要神經遞質，與大腦的學習記憶和認知能力有密切關系［1］。旱蓮草為菊科一年生草本植物鱧腸的全草，為中醫常用的養肝益腎、涼血止血藥物。有研究報道，臨床服用含有旱蓮草的復方抗衰老膠囊，可有效改善老年癡呆的臨床癥狀［2］。本實驗以皮下注射 D-半乳糖聯合雙側海馬注射Aβ25-35方法構建老年癡呆大鼠模型，通過觀察旱蓮草對模型大鼠學習記憶能力及海馬神經元形態結構和海馬中單胺類神經遞質和膽堿能神經遞質含量的影響，進而探討其作用機制，為臨床治療老年癡呆提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康 SPF級成年 SD大鼠40只，體質量(220±20)g，雌雄各半，由河南省實驗動物中心提供 (許可證號 SCXK(豫)2010-0002)。

1.1.2 實驗藥物及試劑 D-半乳糖，上海國藥集團化學試劑有限公司(批號20130812);Aβ25-35，美國Sigma試劑公司(批號A4559);旱蓮草，河南省南陽市醫藥公司;20%烏拉坦，上海國藥集團化學試劑有限公司(批號T20130810);去甲腎上腺素測試盒、多巴胺測試盒、5-羥色胺測試盒、膽堿乙酰轉移酶試劑盒和乙酰膽堿酯酶試劑盒(南京建成生物工程研究 所，批 號 分 別 為 RT131026、RT131123 和RT131122、20130920，20130911);考馬斯亮蘭蛋白測試盒(批號20131008)。

1.1.3 實驗儀器 立體定位儀，成都儀器廠;大鼠避暗儀，中國醫學科學院藥物研究所;酶聯免疫檢測儀，美國伯樂公司;V-1200型可見分光光度計，上海棱譜儀器儀表有限公司;FSH-Ⅱ型高速電動勻漿機，江蘇金運市環宇科學儀器廠;SSW型微電腦電熱恒溫槽，上海博迅實業有限公司醫療設備廠; AE-100型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.1.4 旱蓮草提取物的制備 取旱蓮草500 g加自來水2500 ml煎煮30 min，四層紗布過濾，藥渣用2000 ml自來水煎煮30 min過濾，合并濾液，濃縮至1 g/ml，高壓滅菌，4℃冰箱保存備用。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥 實驗動物在標準環境適應性飼養1周后，按隨機數字表法分為對照組、模型組、藥物低、高劑量組，各組10只。模型組皮下注射D-半乳糖150 mg/kg/d，連續6周，第7周雙側海馬注射4nmol/L的 Aβ25-35(用0.9%的生理鹽水溶解)1次(具體操作詳見方法1.2.2);對照組皮下注射等量生理鹽水，連續6周，第7周雙側海馬注射等量生理鹽水1次;藥物低、高劑量組皮下及雙側海馬注射與模型組相同，藥物組開始造模第1天即開始分別給予8 g/kg、24 g/kg旱蓮草水提物灌胃，均為每日1次，連續8周;對照組和模型組每天給予等劑量生理鹽水灌胃，連續8周。各組動物每周記錄1次體質量，調整注射劑量。

1.2.2 雙側海馬注射方法 10%水合氯醛麻醉大鼠后，將其固定于腦立體定位儀上，頭頂皮膚剪毛，碘伏消毒。手術刀正中矢狀劃開頭皮，剝離骨膜，暴露前囪點(Bergam點)，以Bergam點為坐標原點，參照Paxinos大鼠腦立體定位圖譜［3］，由 Bergam點向后3.2 mm，中線旁2.2 mm，骨鉆鉆透雙側顱骨，腦立體定位儀引導下，微量注射器將總量為4 μl的藥物緩慢注入雙側海馬內 (每側2 μl)，深度為4 mm，速度為0.2 μl/min，注射完成后留針5 min。術畢顱骨上的注射孔用骨蠟封閉、縫合皮膚并給予抗生素處理。

1.2.3 大鼠學習記憶能力測定(避暗實驗)

避暗箱內有一圓形洞口連接明、暗兩室，暗室底部由銅柵構成，通36 V交流電。實驗前，先將大鼠放入避暗箱中適應環境3 min，然后接通銅柵電源，將大鼠放入明室(背對洞口)，因天生具有嗜暗習性大鼠會穿過圓孔進入暗室，在暗室遭到電擊后返回明室，從而獲得暗室遭受電擊記憶，如此反復訓練幾次。24 h后開始測試，記錄潛伏期(從大鼠放入明室至第1次進入暗室遇到電擊所需時間)和錯誤次數(5 min內大鼠受到電擊的次數)。如果5 min內大鼠未進入暗室，則潛伏期記為300 s，錯誤次數記為0次［4］。

1.2.4 大鼠海馬病理形態觀察 大鼠斷頭處死后，在冰凍手術臺上迅速取腦，取出一側海馬組織，40 g/L的多聚甲醛固定 2～5 d。常規石蠟切片，厚約5 μm，HE染色，觀察海馬CA1區神經元形態變化。

1.2.5 大鼠海馬中單胺類神經遞質和膽堿能神經遞質的檢測 將取出的另一側海馬組織放在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血漬，濾紙拭干、稱重，加入9倍體積生理鹽水，用組織勻漿機把海馬組織進一步粉碎，離心機(3500 r/min)離心15 min，取上清液，即得10%組織勻漿。按照試劑盒說明書，采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量，酶聯免疫吸附法測定去甲 腎 上 腺 素 (norepinephrine，NE)、多 巴 胺(dopamine，DA)和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)含量，化學比色法測定膽堿乙酰轉移酶(choline acetyl-transferase，ChAT) 和 乙 酰 膽 堿 酯 酶(acetylcholin esterase，AChE)活力。

1.2.6 統計學方法 采用 SPSS 18.0統計軟件進行統計分析，以均數±標準差(±s)表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，(P＜0.05)為差異有統計學意義，(P＞0.05)為差異無統計學意義。

2 結果

2.1 旱蓮草對老年癡呆模型大鼠學習記憶能力的影響(避暗實驗)

表1顯示，與對照組比較，模型組的潛伏期明顯縮短，錯誤次數增加(P＜0.01);與模型組比較，藥物低、高劑量組潛伏期明顯延長(P＜0.01)，高劑量組錯誤次數顯著降低(P＜0.01)。

表1 各組大鼠學習記憶能力比較(±s)

表1 各組大鼠學習記憶能力比較(±s)

注:與對照組比較:aP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.01;與低劑量組比較:cP＜0.01

組 別 鼠數 潛伏期(s) 錯誤次數(次) 10 212.16± 8.66 1.60±0.52模 型 組 10 155.85±12.98a 2.60±0.70a低 劑 量 組 10 178.79±13.56b 2.10±0.57高 劑 量 組 10 198.55±12.13bc 1.80±0.79對照組b

2.2 旱蓮草對老年癡呆模型大鼠海馬CA1區神經元細胞的影響

圖1顯示，光鏡下觀察各組大鼠海馬CA1區結構如下:對照組錐體細胞排列緊密，細胞結構清晰，大小一致;與對照組比較，模型組錐體細胞排列紊亂，結構不清晰，細胞脫失明顯;與模型組比較，低劑量組錐體細胞排列不整齊，細胞有脫失，高劑量組錐體細胞形態結構基本正常，細胞脫失較少。

2.3 旱蓮草對老年癡呆模型大鼠海馬 NE、DA、5-HT含量和ChAT、AChE活性的影響

與對照組比較，模型組大鼠海馬中NE、DA、5-HT含量明顯降低(P＜0.01);ChAT活性明顯下降，AChE活性明顯增加(P＜0.01)。與模型組比較，藥物高劑量組大鼠海馬中NE、DA、5-HT含量明顯增加(P＜0.01)，ChAT活性明顯升高，AChE活性明顯降低(P＜0.01)。藥物低劑量組和模型組之間上述指標無明顯改變(P ＞0.05)。

表2 各組大鼠海馬NE、DA、5-HT含量和ChAT、AChE活性檢測結果(±s)

表2 各組大鼠海馬NE、DA、5-HT含量和ChAT、AChE活性檢測結果(±s)

注:與對照組比較:aP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.01;與低劑量組比較:cP＜0.01

組 別 NE(μg/g) DA(μg/g) 5-HT(μg/g) ChAT(U/g) AChE(U/mgprot)對 照 組 0.607±0.096 0.827±0.078 0.700±0.066 131.350±16.257 0.694±0.092模 型 組 0.426±0.074a 0.639±0.084a 0.533±0.094a 89.352± 5.970a 0.936±0.163a低 劑 量 組 0.455±0.112 0.685±0.054 0.580±0.111 91.252± 5.522 0.898±0.115高 劑 量 組 0.536±0.069b 0.754±0.110b 0.650±0.090b 113.950±10.946bc 0.740±0.095bc

圖1 各組大鼠海馬CA1區神經元形態結構改變(HE染色 10×40)

3 討論

中醫理論認為，AD的發生是由于“腎虛精虧、瘀血阻絡”。旱蓮草入肝、腎經，具有滋陰補腎、涼血止血之功效［5］，符合 AD的治療理論。學習記憶水平是AD診斷和治療評價中最重要的指標［6］。避暗試驗最早在1967年由 Jarvik和 Kopp創建，是用來檢測大小鼠被動回避學習記憶能力的經典行為學方法［7-8］，即潛伏期越長，錯誤次數越少，表明大鼠學習記憶能力越好。本實驗中避暗實驗發現，與模型組比較，旱蓮草低、高劑量治療組大鼠潛伏期明顯延長，高劑量治療組錯誤次數明顯降低，說明旱蓮草對老年癡呆模型大鼠學習記憶能力下降有一定的治療作用，且采用高劑量治療療效更好。

研究表明［9-10］，學習記憶功能減退與海馬的質量減輕、神經元數目減少及神經元突觸的可塑性改變有關。AD患者海馬的病變往往早于大腦皮質的改變，且隨著病程的延長，病變有加重趨勢。本實驗結果顯示，模型組海馬輪廓模糊，細胞間界限不清，神經元細胞數目減少;藥物高劑量組中海馬結構明顯改善，輪廓清晰，錐體細胞形態結構基本恢復正常，細胞脫失減少，說明旱蓮草對受到損傷的海馬神經元細胞具有保護作用，可通過減少神經元細胞的凋亡起到治療AD的作用。

單胺類神經遞質和膽堿能神經遞質是腦內重要的神經遞質，對學習記憶有重要的調節作用。NE通過軸突聯系廣泛投射到大腦中樞神經系統，調節大腦皮質的興奮狀態，對覺醒、情緒、認知功能和運動有著廣泛影響［11］。DA具有多種生物學效應，如抑制脂質過氧化，減少氧化應激損傷，增加腦部血流供應，改善腦部神經元利用葡萄糖等，與NE一起協同調節機體的興奮狀態［12］。5-HT通過調節乙酰膽堿(acetyl choline，ACh)在腦組織中的釋放，從而調節中樞膽堿能神經活動，是維持智力的重要神經遞質［13］。ACh含量的減少程度與 AD的臨床癥狀嚴重程度密切相關。ChAT是合成 ACh的關鍵酶，AChE是降解ACh的關鍵酶，ChAT和AChE的活性與腦內ACh的含量密切相關，兩者共同維持ACh含量的動態平衡。臨床研究結果顯示，老年人體內單胺類神經遞質和膽堿能神經遞質的減少直接導致老年性癡呆的形成［11-13］。本實驗結果發現，與模型組比較，藥物高劑量組大鼠海馬中NE、DA和5-HT含量均明顯增加，ChAT活性明顯升高，AChE活性明顯降低，說明ACh含量明顯增加。這表明旱蓮草可以改善海馬中單胺類神經遞質和膽堿能神經遞質的代謝，增加海馬中NE、DA、5-HT和ACh的含量，在改善學習記憶功能方面發揮一定的作用。

綜上所述，旱蓮草對老年癡呆模型大鼠學習記憶功能有改善作用，其機制可能與改善AD模型大鼠海馬神經元形態結構、減少神經元細胞的丟失，改善海馬中單胺類神經遞質和膽堿能神經遞質的代謝、增加海馬中NE、DA、5-HT和ACh的含量有關。

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Effect of Eclipta on Learning and Memory and Hippocampal Neurotransmitters in the Senile Dementia Model Rats

WANG Ai-mei，GENG Ruo-jun，LI Yi，CHEN Ya-qi，WEI Xiao-ming，ZHANG Shan，ZHANG Ting
(Nanyang Medical College，Henan Nanyang 473061，China)

Objective:To study the effect of Eclipta alba on learning and memory and hippocampal neurotransmitters in Alzheimer’s disease model rats.Methods:Healthy adult SD rats were randomly divided into 4 groups:control group，model group，low dosage group and high dosage group.The model of Alzheimer’s disease was established with subcutaneous injection of D-galactose and microinjection Aβ25-35on bilateral hippocampus.All rats were treated with different drug lasting 8 weeks.Then，the learning and memory ability of rats were determined.The pathomorphological changes of hippocampal neuron were observed.The contents of norepinephrine(NE)、dopamine(DA)、5-hydroxytryptamine (5-HT)and the activities of choline acetyl-transferase(ChAT)、acetylcholin esterase(AChE)on hippocampus were measured.Results:Compared with the model group，the incubation period prolonged and the error times decreased remarkably in high dosage group;the pyramidal cells decreased insignificantly with the basic restoration of cell morphology in high dosage group;the content of NE、DA and 5-HT increased significantly;the ChAT activity increased significantly，the AChE activity decreased significantly in high dosage group.Conclusion:Eclipta alba could raise the learning and memory function of AD rats by the mechanism of improving the hippocampus nerve cells’morph and structure，improving the metabolism of neurotransmitters on hippocampus.

Eclipta alba;Alzheimer’s disease;Learning and memory;NE;DA;5-HT;ChAT;AChE

R285.5

:B

:1006-3250(2016)03-0332-04

2015-07-16

河南省重點科技攻關項目(132102310263)

王愛梅(1973-)，女，副教授，從事生理學教學與研究。