寒濕環境對佐劑關節炎模型大鼠炎癥反應的影響*

陳 歡，任香怡，魏江平，巨少華，胡 勇，徐世軍△

(1.成都中醫藥大學，成都 611137;2.四川省中藥資源系統研究與開發利用國家重點實驗室培育基地，成都 611137)

【實驗研究】

寒濕環境對佐劑關節炎模型大鼠炎癥反應的影響*

陳 歡1，2，任香怡1，2，魏江平1，2，巨少華1，2，胡 勇1，2，徐世軍1，2△

(1.成都中醫藥大學，成都 611137;2.四川省中藥資源系統研究與開發利用國家重點實驗室培育基地，成都 611137)

目的:考察寒濕環境對佐劑性關節炎模型大鼠炎癥反應的影響及烏頭湯的干預回調作用，綜合揭示“風寒濕三氣雜至合而為痹”的科學內涵。方法:采用佐劑性關節炎模型復合寒濕環境制備寒痹動物模型，從造模第6天開始每隔4 d測定大鼠足容積并計算足腫脹率，第16天開始給予烏頭湯干預治療30 d，第45天觀察踝關節病理形態學及檢測大鼠血清白介素-6(IL-6)、類風濕因子(RF)、抗-環瓜氨酸多肽抗體(anti-CCP)的含量水平。結果 給予大鼠寒濕環境刺激后，寒濕對照組與模型對照組比較，足腫脹率、病理損傷程度以及血清因子IL-6、RF、anti-CCP均無統計學意義，但均呈上升趨勢;烏頭湯治療后與寒濕對照組比較，大鼠足腫脹率31 d后顯著下降，大鼠踝關節損傷明顯改善，血清因子IL-6、RF、anti-CCP水平明顯降低。結論:寒濕環境通過加重完全弗氏佐劑性關節炎大鼠關節炎癥反應，促進RA疾病的發展，且烏頭湯具有較好的回調干預作用。

寒濕環境;佐劑性關節炎模型;烏頭湯

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)屬于痹癥范疇。中醫認為RA發病是因于本虛，“風寒濕三氣雜至”或“風寒濕氣中其俞”成痹，指出環境因子在RA發病中具有極其重要的地位。西醫認為RA是一種以慢性關節滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，環境和遺傳因素都是其發病的關鍵因素。雙胞胎人群樣本研究表明，環境因素對RA發展比遺傳因素更為重要［1］。當外界溫度下降或濕氣加重均會導致由炎癥引發的關節疼痛等不適感［2-3］，此外環境因素可通過改變基因的表觀遺傳修飾參與RA的免疫應答［4］。目前由于中醫證的模型缺乏，疾病模型在RA研究和藥物評價中得到廣泛應用，其中佐劑性關節炎模型(Adjuvant arthritis model，AA)因為與人類 RA病理改變相近應用更廣。研究表明，環境因素對佐劑性關節炎模型自身抗體表達和關節損壞程度有明顯影響［5］。但目前尚無環境因素對該模型炎癥因子影響的研究報道，也未見采用“以方測證”思路的經方干預評價的研究報道。

1 材料與方法

1.1 動物和藥物

SPF級雄性 SD大鼠，體質量140～160 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供(動物合格證號SCXK(川)2013-24)。

依照上海中醫學院1982年版《中醫方劑與臨床手冊》烏頭湯的組成和用量為川烏15 g、黃芪15 g、麻黃9 g、白芍9 g、甘草9 g，并按2010版《中華人民共和國藥典》加工炮制后組方，常規方法制備成100%標準湯劑;醋酸地塞米松片，浙江仙琚制藥股份有限公司(批號120245)。

1.2 實驗儀器和試劑

足趾容積測量儀(成都泰盟科技有限公司); 3001全自動酶標儀(Thermo Scientific);轉輪式切片機(德國徠卡-2016);TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機(常州市中威電子儀器有限公司);BMJ-Ⅲ型包埋機(常州郊區中威電子儀器廠);數碼三目攝像顯微鏡，BA400Digital(麥克奧迪實業集團有限公司);圖像分析軟件Motic Images Advanced。

完全弗氏佐劑(CFA)購于 sigma公司(批號SLBB1397);anti-CCP-ELISA檢測試劑盒、RF-ELISA檢測試劑盒、IL-6-ELISA檢測試劑盒，武漢華美生物科技有限公司提供(批號 O04033624、O31033614、O31033612)。

2 方法

2.1 分組與造模

將40只雄性 SD大鼠按隨機數字表法分為5組，即空白對照組、模型對照組(CFA)、寒濕對照組(CFA+寒濕)、地塞米松組(CFA+地塞米松)和烏頭湯組(CFA+寒濕+烏頭湯)各8只［6］。

造模方法參照如下［5］，除空白對照組注射0.1 ml生理鹽水外，其余大鼠右后足底均注射 0.1 mlCFA。寒濕對照組與烏頭湯組2組大鼠造模后每天置于2～8℃、相對濕度70% ～80%的環境下6 h。

2.2 給藥

造模后第16天開始，給藥組大鼠分別按60 kg成人等效劑量給予灌胃烏頭湯(7.98 g/kg)、地塞米松(5 mg/kg)，其余各組大鼠均給予等量蒸餾水，藥體積為20 ml/kg，每日1次，連續30 d。

2.3 足腫脹率測定

表1顯示，造模前測定各大鼠的右后足容積2次，取平均值作為正常足容積;造模后第6天開始，每隔4 d測定大鼠的足容積2次取平均值，同時記錄大鼠體質量直至45 d。計算并比較各組的足腫脹率［E(%)=(Vt－Vn)/m，Vt為造模后足容積，Vn為造模前正常足容積，m為大鼠測量足容積當天體質量］。

2.4 踝關節組織病理學檢測

圖1表2顯示，末次給藥后取大鼠右后踝關節，以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡觀察組織病理變化，并采用以下標準進行病理形態學評分:炎性細胞浸潤評分:0:無;1:稀疏、散在;2:較密集;3:大量。滑膜組織增生評分:0:無;1:單層;2:2層;3:3層。纖維組織增生評分:0:無;1:少量增生;2:中等;3:大量。巨噬細胞增生評分:0:無;1:稀疏;2:較密集;3:大量。

2.5 檢測血清因子

表3顯示，實驗第45天末次給藥后，各組大鼠股動脈取血，制備血清。按照ELISA法說明書步驟檢測血清中IL-6、RF、anti-CCP含量水平。

表1 各組大鼠足腫脹率變化(±s)

表1 各組大鼠足腫脹率變化(±s)

注:與模型對照組比較:*P＜0.05;與寒濕對照組比較:#P＜0.05

組別 鼠數 給藥劑量/g·kg－11 d /ml·g－16 d /ml·g－111 d /ml·g－116 d /ml·g－121 d /ml·g－126 d /ml·g－131 d /ml·g－136 d /ml·g－141 d /ml·g－145 d /ml·g－1空 白 組 8 — 0.005±0.00 0.08±0.03* 0.11±0.03* 0.19±0.02 0.18±0.04* 0.14±0.03* 0.14±0.05* 0.16±0.03* 0.15±0.03* 0.16±0.03*模 型 對 照 組 8 — 0，005±0.00 0.43±0.09 0.56±0.14 0.58±0.14 0.56±0.18 0.53±0.18 0.59±0.19 0.52±0.16 0.53±0.16 0.55±0.14寒 濕 對 照 組 8 — 0.005±0.000.52±0.11 0.59±0.17 0.61±0.11 0.67±0.18 0.64±0.17 0.61±0.19 0.54±0.12 0.56±0.14 0.59±0.15地 塞 米 松 組 8 5 mg 0.005±0.000.47±0.07 0.48±0.07 0.46±0.08 0.40±0.07 0.38±0.09* 0.34±0.10* 0.29±0.05* 0.26±0.08* 0.22±0.07*烏 頭 湯 組 8 7.98 0.006±0.000.41±0.09 0.59±0.11 0.60±0.12 0.59±0.08 0.49±0.09 0.44±0.14# 0.35±0.09# 0.31±0.13# 0.38±0.13#

表2 各組大鼠踝關節病理學評分結果(±s)

表2 各組大鼠踝關節病理學評分結果(±s)

注:與模型對照組比較:*P＜0.05;與寒濕對照組比較:#P＜0.05

組別 鼠數 給藥劑量/g·kg－1炎性細胞浸潤 纖維組織增生 滑膜組織增生 巨噬細胞增生空白對照組 8 — 0* 0* 0* 0*模 型對照組 8 — 15 18 17 16寒 濕對照組 8 — 18 20 21 18地 塞 米 松 組 8 5 mg 10* 13* 10* 9*烏 頭 湯 組 8 7.98 11# 12# 11# 10#

3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，以均數±標準差(±s)表示，各組數據呈正態分布，不符合正態分布時采用非參數檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

4 結果

4.1 各組大鼠足腫脹率的變化

表1顯示，與模型對照組比較，寒濕對照組大鼠足腫脹率從第6天開始逐漸增加，第21天達到峰值，第36天出現上升趨勢至實驗結束;烏頭湯干預治療以后，與寒濕對照組比較，給藥后大鼠足腫脹率從第21天開始呈下降趨勢，從第31天開始均呈顯著下降(P＜0.05)。

圖1 各組大鼠踝關節病理學HE染色結果(HE ×100)

表3 各組大鼠血清中IL-6、RF、anti-CCP含量變化比較(±s)

表3 各組大鼠血清中IL-6、RF、anti-CCP含量變化比較(±s)

注:與模型對照組比較:*P＜0.05;與寒濕對照組比較:#P＜0.05

組別 鼠數 給藥劑量/g·kg－1 IL-6/pg·ml－1 RF/mIU·ml－1 anti-CCP/IU·ml－1空 白 對 照 組 8 — 38.966± 7.448* 83.163±32.228* 23.252±14.247*模 型 對 照 組 8 — 289.128±12.543 240.954±62.029 125.623±24.354寒 濕 對 照 組 8 — 298.376±15.181 264.340±64.874 126.248±30.577地 塞 米 松 組 8 5 mg 145.721±47.556* 144.725±36.267* 36.544±26.093*烏 頭 湯 組 8 7.98 176.238±31.055# 176.023±44.423# 42.041±29.188#

4.2 各組大鼠踝關節病理學變化

4.2.1 HE染色結果 圖1顯示，正常大鼠踝關節滑膜細胞單層排列整齊，無血管增生，無纖維化，無乳頭狀增生，未見炎細胞浸潤。模型對照組可見關節滑膜增生明顯，毛細血管增多擴張充血以及炎細胞浸潤;寒濕對照組可見滑膜細胞增生活躍，滑膜組織中纖維組織增生，毛細血管增生及充血嚴重，可見大量炎性細胞浸潤及纖維母細胞浸潤。烏頭湯組滑膜腫脹、充血程度及滑膜細胞增生，較寒濕對照組減輕，未見明顯炎細胞浸潤及血管增生、纖維化不明顯。

4.2.2 病理評分 表2顯示，寒濕對照組的炎性細胞浸潤、滑膜組織增生、纖維組織增生、巨噬細胞增生均高于模型對照組，但差異無統計學意義(P＞0.05)。經烏頭湯治療以后，烏頭湯組的炎性細胞浸潤、滑膜組織增生、纖維組織增生、巨噬細胞增生較寒濕對照組均明顯下降(P＜0.05)。

4.3 各組大鼠血清中IL-6、RF、anti-CCP含量的變化

表3顯示，寒濕對照組與模型對照組比較，血清中IL-6、RF、anti-CCP水平均有上升趨勢，但差異無統計學意義(P＞0.05);烏頭湯組與寒濕對照組比較，血清中IL-6、RF、anti-CCP水平均明顯降低(P＜ 0.05)。

5 討論

大量證據表明，RA的發展進程與環境因素誘發個體遺傳危險因素有關。RA危險因素臨床對照研究表明，居住環境、氣候變化等環境因素是引發RA的第三重要危險因素［7］。RA遺傳易感宿主暴露于環境危險因素下，觸發伴隨自身抗體產生的自身免疫反應的發生，推動機體免疫失調，最終發展成炎癥性關節炎［8］。而對 RA全組基因相關研究證實，RA發病機制與遺傳因素和環境因素在人類白細胞抗原(HLA)DRB1等位基因和其他風險等位基因上的相互作用有關，在基因水平上論證了環境因素與RA的關系［9-10］。在RA發病階段中，環境因素刺激機體產生免疫反應，在此過程中發現有大量與炎癥反應相關的自身抗體和細胞因子［11-13］。自身抗體RF和Anti-CCP積聚于關節滑膜上，導致關節產生大量炎癥細胞因子，引發 RA全身炎癥反應［14］。實驗證明，RA患者自身抗體水平升高常伴隨炎癥因子水平的升高，如IL-1、TNF-α、IL-6等，而IL-是重要的促炎因子，在炎癥發展中起重要的作用［15-17］。以病的模型研究證實，表征的更多是藥物的共性特征，而對藥物的個性特征體現不明顯。本實驗依據“以方測證”的思路，經與方證相應的經典名方烏頭湯干預治療后，研究環境因素對RA形成及發展的影響。本研究結果顯示，足腫脹率不同測定點寒濕對照組均較模型對照組升高，第21天達到峰值，提示寒濕環境加重了佐劑性關節炎模型大鼠足腫脹程度。病理結果與足腫脹率結果吻合，均顯示寒濕環境加重了佐劑性關節炎模型大鼠踝關節損傷程度，推動了 RA疾病的發展。寒濕對照組大鼠血清中RF、anti-CCP、IL-6的表達水平均較模型對照組升高，與足腫脹率、病理結果一致，提示寒濕環境可能通過上調血清中IL-6、RF、anti-CCP三者水平，擴大佐劑性關節炎的炎癥反應，加重RA的疾病程度。烏頭湯干預治療后，大鼠足腫脹程度得到明顯減輕，踝關節病理狀態得到較好改善，血清中IL-6、RF、anti-CCP的分泌水平發生不同程度下調，說明烏頭湯對由寒濕環境刺激后加重的炎癥反應有顯著的回調作用。從以上結果得出結論，寒濕環境因素可能通過上調自身抗體以及炎癥因子水平加重完全弗氏佐劑性關節炎大鼠的炎癥反應，而烏頭湯下調炎癥因子水平，回調由寒濕環境引起的炎癥反應。本實驗只在細胞因子水平上對寒濕環境是否影響RA進行了探討，缺乏從基因分子層面研究寒濕環境對RA影響的探究，兩者結果是否一致還有待進一步的研究。

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Effects of Cold Environment on the Inflammatory Reaction of Adjuvant Arthritis in Rats

CHEN Huan1，2，REN Xing-yi1，2，WEI Jiang-ping1，2，JU Shao-hua1，2，HU Yong1，2，XU Shi-jun1，2△
(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China; 2.Key Laboratory of Systematic Research and Exploitation of TCM Resources in Sichuan Province，Chengdu 611137，China)

Objective:To observe the influence of cold-damp environment on inflammation of AA rats and evaluate the therapeutic effect of Wutou decoction.Methods:Establish the cold-arthralgia-syndrome rat model caused by complete Freund’s adjuvant combined with cold and dampness environment.Rats’paw volumes were measured every five days from the first modeling day.Sprague-Dawley rats of Wutou decoction group were treated with Wutou decoction(4.9 g·kg－1) continued 30 days after modeling 15 days.Histopathological examination was done for ankle joint and serum was analyzed for Interleukin-6(IL-6)，Rheumatoid factor(RF)and Anti-cyclic citrullinated peptide antibodies(anti-CCP)by ELISA kits at 45th day after injecting.Results After the stimulation of cold-dampness environment，compared with the model group，the paw swelling，injury of ankle joint and the level of IL-6，RF and anti-CCP of the cold-dampness group had an increasing tendency.But these results about all showed no statistical significance.With Wutou decoction therapy，the paw swelling significantly decreased after the 31 d，the injury of the ankle joint tissues was obviously recovered and IL-6，RF and anti-CCP revealed an increased tendency compared with the cold-damp group.Conclusion:The cold-dampness environment can aggravate inflammation of AA rats’model and contribute to pathology development of rheumatoid arthritis.Wutou decoction can impede inflammation induced by cold-dampness environment.

Cold-dampness environment;Complete Freund’s adjuvant arthritis;Wutou decoction

R593.22

:B

:1006-3250(2016)03-0328-04

2015-01-12

國家自然科學基金面上項目(81273900);中藥藥理四川省青年科技創新研究團隊(2014TD0007);四川省科技創新苗子工程培育項目(2014-089)

陳 歡(1989-)，女，重慶人，在讀碩士，從事中藥抗炎與免疫藥理學研究。

△通訊作者:徐世軍，男，甘肅人，教授，從事中藥神經與精神藥理學、中藥效應的信號轉導機制和中藥抗病毒、抗炎與免疫藥理學研究，Tel:028-61800231，E-mail:docxu@126.com。