超高效液相色譜-高分辨率質譜法篩查化妝品中12種糖皮質激素

李　強，張曉光，馬俊美，李潤巖，范素芳，張　巖*

(1．河北省食品檢驗研究院，河北　石家莊　050091；2.河北省食品安全重點實驗室，河北　石家莊　050091)

?

超高效液相色譜-高分辨率質譜法篩查化妝品中12種糖皮質激素

李強1,2，張曉光1,2，馬俊美1,2，李潤巖1,2，范素芳1,2，張巖1,2*

(1．河北省食品檢驗研究院，河北石家莊050091；2.河北省食品安全重點實驗室，河北石家莊050091)

摘要：建立了超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質譜快速篩查和確證化妝品中可能添加的12種糖皮質激素的分析方法。樣品經乙腈提取，用Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)分離，以0.1%甲酸甲醇和0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫。以正離子全掃描模式得到糖皮質激素的精確質量數，與理論精確質量數對比，精確度偏差小于2×10-6。建立了篩查列表，并將12種糖皮質激素物質的二級質譜數據庫加入確證條件中，實現了對12種糖皮質激素類物質的快速篩查。檢出限為1~2 μg/kg，定量下限為3~5 μg/kg；加標水平為10,20,40 μg/kg時，回收率為78.3%~112.5%，相對標準偏差(RSD)為1.0%~11.2%。該方法可作為化妝品中非法添加糖皮質激素成分的高通量篩選和確認檢測方法。

關鍵詞：超高效液相色譜；四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜；糖皮質激素；化妝品

隨著人們生活水平的提高，化妝品成為不可缺少的消費類產品。化妝品是指以涂擦、噴灑或其他類似的方法，散布于人體表面任何部位(皮膚、毛發、指甲、口唇等)，以達到清潔、消除不良氣味、護膚、美容和修飾目的的日用化學工業產品[1]。據統計，中國已成為全球最大的化妝品市場之一，化妝品年銷售額達2 000多億元，約占全球化妝品市場的8.8%，僅次于美國[2]。伴隨著化妝品市場的高增長和高需求，化妝品質量問題日益突出，含毒化妝品嚴重危害人們的身體健康。

糖皮質激素是皮膚科最常見的外用藥物，可抑制纖維細胞再生，對皮膚具有一定的美白功效，但長期使用會產生激素依賴癥及其他副作用，甚至引發癌癥，對人體造成嚴重傷害。我國《化妝品衛生規范》2007版明確規定，糖皮質激素屬于禁用物質[3]。但是，由于其具有明顯的美白、祛痘等效果，不少廠家仍然非法向化妝品中添加糖皮質激素類物質。近期曝光的含有糖皮質激素的“毒面膜”事件，使得化妝品安全問題又被推到了輿論的風口浪尖。由此可見，研究糖皮質激素類物質的檢測，建立簡單高效的篩查方法對于行業監管和保障消費者權益具有十分重要的意義。

目前，糖皮質激素的檢測方法主要有液相色譜法[4]、液相色譜-三重四極桿質譜聯用法[5-9]以及毛細管電泳法[10-12]。但以上方法均存在分辨率低、檢測種類有限、易造成假陽性等問題。近年來，以飛行時間質譜和靜電場軌道阱質譜為代表的液相色譜-高分辨質譜聯用法逐漸成為研究熱點。靜電場軌道阱的原理是利用不同物質在阱中運動軌跡不同而實現精確定量，可得到一級精確質量數以及多級結構碎片，且可以自建數據庫。靜電場軌道阱為目標分析物提供精準而全面的數據，大大降低了篩查和確證的誤差，在食品保健品非法添加檢測[13-14]、農藥殘留檢測[15-16]、化妝品禁用物質篩查[17-18]等領域得到了一定應用，但將其用于檢測化妝品中激素的研究較少。本文利用超高效液相色譜-靜電場軌道阱質譜聯用儀建立了化妝品中12種糖皮質激素的快速篩查和確證方法，為政府部門對化妝品市場監管提供了有效的補充方案。

1實驗部分

1.1儀器、材料和試劑

Ultimate 3 000超高效液相色譜儀(美國ThermoFisher公司);Q-Exactive超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱組合式高分辨質譜儀(美國ThermoFisher公司);高速冷凍離心機(美國Sigma公司);IKA Vortex Genius 3旋渦混合器(德國IKA公司)；KQ-250DV型超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

甲酸(色譜純，美國Sigma公司);甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher公司);實驗用水為自制的二級水，符合GB/T6682規定；12種糖皮質激素標準品均購自中國食品藥品檢定研究院，純度≥95%，標準儲備液用甲醇配制，系列標準工作液用乙腈-水溶液(體積比3∶7)配制；化妝品購于當地超市。

1.2樣品前處理

稱取1.00 g(精確至0.001 g)樣品，置于50 mL離心管中，加入5 mL水，渦旋3 min，再加入5 g NaCl、10 mL乙腈，渦旋1 min，超聲15 min，于4 ℃下以10 000 r/min離心3 min，移取上層清液，加入10 mL正己烷，劇烈振蕩1 min后棄去正己烷層，剩余乙腈層再加入10 mL正己烷，劇烈振蕩1 min后棄去正己烷層，剩余乙腈層過0.22 μm濾膜，上機測定。

1.3儀器條件

1.3.1色譜條件色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm;美國Waters公司)。流動相A為水(含0.1%甲酸)，B為甲醇(含0.1%甲酸)。梯度洗脫程序:0~2 min，B相保持30%；2~6 min，B相從30%線性升至95%;6~8 min，B相保持95%;8~9 min，B相從95%線性降至30%;9~10 min，B相保持30%。

1.3.2質譜條件質量分析器：四極桿-靜電場軌道阱；電噴霧離子源；鞘氣流量：35 Arb；輔助氣流量10 Arb；噴霧電壓：3.8 kV；離子源溫度：350 ℃；毛細管溫度：320 ℃。

一級精確質量數獲取采用正離子全掃描模式，質量掃描范圍：m/z150~8 000。二級碎片圖譜獲取采用目標離子監測模式，分辨率17 500，碰撞能量為35%。

樣品檢測采用正離子全掃描+基于數據依賴的二級質譜碰撞解離(Full MS+ddMS2)掃描模式；全掃描分辨率：70 000；基于數據依賴的二級質譜碰撞解離分辨率：17 500；碰撞能量為35%。

2結果與討論

2.1樣品的提取

由于化妝品基質較為復雜，因此需要選擇合適的提取溶劑。本實驗選取了3種不同的提取溶劑(甲醇、乙腈、乙酸乙酯)和不同的超聲時間(5，10，15，20，25 min)，按照“1.2”方法進行樣品前處理，考察了12種糖皮質激素的回收率(樣品空白基質加標濃度10 μg/kg)。結果表明，在相同的超聲時間下，以甲醇為提取溶劑時，甲醇和水無法分層，溶液較為渾濁，造成過濾膜困難；以乙腈和乙酸乙酯為提取溶劑時，在加入鹽的情況下，乙腈和乙酸乙酯均能和水分層，12種糖皮質激素的回收率分別為78.3%~111.1%和57.1%~119.8%，由于乙酸乙酯和正己烷互溶，因此無法實現加入正己烷以進一步除去雜質的目的。而在乙腈中加入正己烷后，對12種糖皮質激素的回收率幾乎無影響。因此選取乙腈為提取溶劑，在該條件下，考察了超聲時間對回收率的影響，發現隨著超聲時間的增加，提取效果增加，當超過15 min后，提取回收率增加不明顯，因此選擇超聲時間為15 min。

2.2色譜-質譜條件的優化

考察了4種不同的流動相體系(水-甲醇、水-乙腈、 0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇、0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈)對色譜峰形和出峰強度的影響。結果表明，使用水-甲醇以及0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇2種流動相體系得到的色譜峰形較優；當使用乙腈為流動相時，潑尼松和地夫可特的出峰出現分叉，而使用甲醇為流動相時，所有目標分析物的峰形良好，但使用0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇流動相所得的峰面積大于水-甲醇流動相所得的峰面積，這可能是由于加入甲酸，對正離子模式電離起到了增強作用。

分別采用正離子模式和負離子模式對12種糖皮質激素的質譜條件進行優化，結果表明，12種糖皮質激素均可產生[M+H]+以及[M-H]-分子離子峰，但在負離子模式下，產生的[M-H]-分子離子峰強度較小，約為正離子模式下[M+H]+峰強度的1/10，且產生的二級碎片信息較少，不利于定性篩查。

綜上所述，本實驗確定以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇作為流動相，正離子模式進行全掃描，提取[M+H]+分子離子峰。12種糖皮質激素的提取離子色譜圖見圖1。

2.3基質效應的評價

由于化妝品基質較為復雜，提取液中的非目標組分可能對目標分析物產生影響。雖然靜電場軌道阱質譜比三重四極桿質譜具有更強的抗干擾能力，但仍然存在基質效應，因此，需要對基質效應進行評價。本實驗將12種糖皮質激素標準品混標分別用乙腈和空白基質提取液配制成一系列濃度標準曲線(2，10,50,100,200，500 ng/mL)，以相同物質在不同基質中標準曲線的斜率大小來判斷基質效應情況(見表1)。結果表明，12種糖皮質激素在空白基質中均為基質抑制效應，其中哈西奈德的抑制效應最為明顯。

表1　12種糖皮質激素的基質效應比較

2.4理論精確質量數的驗證

本方法以正離子模式全掃描方式運行，12種糖皮質激素得到較好的分離效果，且提取的精確質量數與理論精確質量數相差較小，精確度誤差均小于2×10-6(5 ppm)，具體質量精度見表2。

圖1　12種激素化合物的提取離子色譜圖

AnalyteRetentiontime/minTheoreticalmassm/zMeasuredmassm/zMassaccuracyerror/10-6Prednisolone3.85361.20152361.201350.47Prednisone3.15359.18581359.185640.47Methylprednisolone4.63375.21714375.217250.29Betamethasone4.48393.20770393.207470.58Flumethasone4.32411.19833411.198670.83Deflazacort5.00442.22304442.222750.66Budesonide5.59431.24348431.243290.44Diflorasonediacetate5.36495.21947495.219390.16Halcinonide5.81455.20018455.199651.16Amcinonide6.01503.24450503.244570.14Betamethasonedipropionate6.08505.26023505.260620.77Clobetasone17-butyrate6.00479.20018479.200290.23

2.5基于二級質譜圖庫篩查方法的建立

利用Extract Finder軟件建立篩查方法，首先采用目標離子監測(Target MS2)方法，對12種糖皮質激素的二級質譜數據進行采集，將采集的二級特征圖譜添加入二級質譜數據庫。其次，建立12種糖皮質激素的篩查列表，將理論分子式、保留時間、特征碎片離子、同位素理論分布、二級質譜數據等加入篩查列表，并設置各指標的偏差范圍，對于未知樣品，采用正離子全掃描+基于數據依賴的二級質譜碰撞解離(Full MS+ddMS2)模式運行，將采集的原始數據導入篩查列表，系統通過對各個參數進行計算，最終得到確證結果。

2.6方法學驗證

用空白基質配制一系列的標準工作液，以12種糖皮質激素的一級質量數提取離子峰面積(y)為縱坐標，相應的質量濃度(x,ng/mL)為橫坐標，進行線性回歸計算，得到線性方程、線性范圍、相關系數。采用空白基質配制標準溶液，以3倍信噪比和10倍信噪比對應的質量濃度分別作為方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，結果見表3。在空白基質中添加12種糖皮質激素，添加水平分別為10，20，40 μg/kg，每個添加水平平行測定6 次，回收率與相對標準偏差(RSD)結果見表4。12種化合物在2~500 ng/mL范圍內呈良好的線性關系，檢出限為1~2 μg/kg，定量下限為3~5 μg/kg，回收率為78.3%~112.5%，RSD為1.0%~11.2%。該方法完全能夠滿足實際樣品的篩查和確證需要。

表3　12種化合物的線性關系、線性范圍、檢出限與定量下限

表4　12種糖皮質激素的回收率與相對標準偏差

圖2　某化妝品樣品中倍他米松的提取離子色譜圖Fig.2　Extracted ion chromatogram of betamethasone in a real sample

2.7實際樣品的檢測

利用本方法對購自超市的20份化妝品進行篩查分析，在某品牌化妝品中檢出倍他米松(見圖2)，含量為280 μg/kg。將原始數據導入建立的篩查列表進行篩查，結果顯示，該化妝品中含有倍他米松，其在保留時間、一級母離子、二級碎片離子、同位素理論分布等方面與倍他米松標準物質高度一致(提取的母離子、主要子離子誤差小于5 ppm)。根據歐盟2002/657/EC的規定，利用高分辨率質譜對禁用藥物確認至少需要4個識別點，而利用本方法，獲得了大于9個識別點(母離子505.260 62,碎片離子149.023 51,71.086 33,279.174 20)的定性分數。利用國標GB/T24800.2-2009《化妝品中四十一種糖皮質激素的測定 液相色譜/串聯質譜法和薄層層析法》對該樣品進行測定，得到倍他米松的含量為302 μg/kg，與本方法測定的含量相差較小。由此可見，利用本方法對化妝品中糖皮質激素進行篩查和確認是可行的。

3結論

本實驗利用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱串聯質譜對化妝品中的12種糖皮質激素物質進行篩查。在10 min內完成了對12種糖皮質激素較好的分離，建立了篩查列表以及二級質譜圖數據庫，篩查確證結果可信度較高，該方法前處理簡便、抗干擾性強，可實現在無標物情況下對樣品的篩查，且自建數據庫可擴充，是對現有國家標準檢測化妝品中糖皮質激素物質的有力補充。

參考文獻：

[1]Lu Y，Qiu Y H，Chen P P，Liu J J,Wang T J，Li J.Chin.J.Pharm.Anal.(魯藝，邱穎姮，陳平平，劉吉金，王鐵杰，李軍.藥物分析雜志)，2010,30(10):1913-1914.

[2]China Information.ChinaHasBecometheLargestCosmeticsConsumerMarketwithAnnualConsumptionof200Billion.(中國報告大廳.我國成全球最大化妝品市場之一年銷售額達2000億),[2015-01-19].http://www.chinabgao.com/stat/stats/40148.html.

[3]Hygienic Standard for Cosmetics.Ministry of Health of the People’s Republic of China(化妝品衛生規范.中華人民共和國衛生部).[2007-01].

[4]Zhao X Y，Lin Y F，Hu X Z,Fu X F，Li J，Wang P.Chin.J.Anal.Lab.(趙曉亞，林雁飛，胡小鐘，付曉芳，李晶，王鵬.分析試驗室)，2009,28(2):111-115.

[5]Wang W P，Zhang M Y，Lin J，Yakufu P.Chin.J.Pharm.Anal.(王偉萍，張明玥，藺娟，帕孜來提·亞庫甫.藥物分析雜志)，2013,33(5):837-843.

[6]Xu J Z，Zhang X Y，Ding T，Wu B，Shen C Y，Jiang Y，Liu F.Chin.J.Anal.Chem.(徐錦忠，張曉燕，丁濤，吳斌，沈崇鈺，蔣原，劉飛.分析化學)，2009,37(3):341-346.

[7]Tan L C，Ge F，Shan Z J，Wang Y.Chin.J.Anal.Chem.(譚麗超，葛峰，單正軍，王懿.分析化學)，2012,40(4):545-550.

[8]Zhang Y J，Li X D.J.Instrum.Anal.(張雅軍，李曉東.分析測試學報)，2007,26(Suppl):67-68.

[9]Xia R，Che B Q，Zhang Z.Chin.J.Chromatogr.(夏瑞，車寶泉，張喆.色譜)，2007,25(6):926-929.

[10]Sun X T，Shang S M，Chen X Y，Wang Y，Li J.Chin.J.Anal.Chem.(孫雪婷，商少明，陳秀英，汪云，李娟.分析化學)，2014,42(1):36-40.

[11]Chen X，Tian Z Z，Liu Y，Huang Y，Cao Y H.J.Instrum.Anal.(陳新，田志壯，劉瑛，黃堯，曹玉華.分析測試學報)，2011,30(2):203-206.

[12]Li B X，Zheng M M，Lu L X，Wu X P.Chin.J.Chromatogr.(李博祥，鄭敏敏，盧蘭香，吳曉蘋.色譜)，2011,29(8):798-804.

[13]Chen D W,Lü B,Zou J H,Yang X,Miao H,Zhao Y F.J.Instrum.Anal.(陳達煒，呂冰，鄒建宏，楊欣，苗虹，趙云峰.分析測試學報)，2014,33(12):1327-1333.

[14]Ding T，Lü C，Liu H，Guo L，Wu B，Chen G S，Shen C Y，Zhang R，Fei X Q，Zhang X Y，Yu J L.J.Instrum.Anal.(丁濤，呂辰，柳菡，郭玲，吳斌，陳國松，沈崇鈺，張睿，費曉慶，張曉燕，庾金良.分析測試學報)，2014,33(1):27-32.

[15]Wu B，Ding T，Liu H，Chen H L，Zhao Z Y，Zhang R，Shen C Y.Chin.J.Chromatogr.(吳斌，丁濤，柳菡，陳惠蘭，趙增運，張睿，沈崇鈺.色譜)，2012,30(12):1246-1252.

[16]Sun Y A，Wang K，Li Z X，Yu W H，Wang G Q.J.HenanNormalUniv.：Nat.Sci.Ed.(孫雨安，王珂，李振興，于文浩，王國慶.河南師范大學學報:自然科學版)，2015,43(3):69-73.

[17]Li Z Y，Wang F M，Niu Z Y，Luo X，Chen J H，Wang X R.J.Anal.Sci.(李兆永，王鳳美，牛增元，羅忻，陳軍輝，王小如.分析科學學報)，2015,31(2):171-177.

[18]Li Z Y，Wang F M，Niu Z Y，Luo X，Zhang G，Chen J H.Chin.J.Chromatogr.(李兆永，王鳳美，牛增元，羅忻，張罡，陳軍輝.色譜)，2014,32(5):477-484.

Screening of 12 Glucocorticoids in Cosmetics by High Performance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry

LI Qiang1,2，ZHANG Xiao-guang1,2，MA Jun-mei1,2，LI Run-yan1,2，FAN Su-fang1,2，ZHANG Yan1,2*

(1.Hebei Food Inspection and Research Institute，Shijiazhuang050091，China;2.Key Laboratory of Food Safety of Heibei Province,Shijiazhuang050091，China)

Abstract：A method was developed for screening of 12 kinds of glucocorticoids in cosmetics by high performance liquid chromatography-quadrupole/orbitrap high-resolution mass spectrometry(Orbitrap MS) .The samples were extracted with acetonitrile,and separated with an Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm) using a binary solvent system composed of 0.1% formic acid methanol solution and 0.1% formic acid water solution by gradient elution.Accurate mass number of target compound were got in full scan mode.Compared to accurate mass number in theory,the mass accuracy error was below 2×10-6.The screening list was built,and the database of secondory characteristic fragment ions for the glucocorticoids were added in screening option.Qualitative screen was achieved.The limits of detection(LOD) of the method ranged from 1 μg/kg to 2 μg/kg，and the limits of quantitation(LOQ) ranged from 3 μg/kg to 5 μg/kg．Satisfactory recoveries from 78.3% to 115.2% were obtained at spiked concentration levels of 10,20,40 μg/kg,and the relative standard deviations(RSDs) were in the range of 1.0%-11.2%.The method could be used for the determination of glucocorticoid in cosmetics as a high-throughput and confirmatory method.

Key words：ultra high performance liquid chromatography;orbitrap mass spectrometry(Orbitrap MS);glucocorticoid;cosmetic

中圖分類號：O657.63；O629.8

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)02-0179-06

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.02.008

*通訊作者：張巖，博士，高級工程師，研究方向：化學生態學，Tel：0311-67568335，E-mail：snowwinglv@126.com

收稿日期：2015-08-19；修回日期：2015-09-16