HPLC法測(cè)定人參皂苷Rg3、Rh1的含量

翁　硯，王曉非，劉同帥，畢　華，董金香,翁麗麗*

(1.白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠(chǎng)，長(zhǎng)春 130012；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117)

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HPLC法測(cè)定人參皂苷Rg3、Rh1的含量

翁硯1，王曉非1，劉同帥2，畢華2，董金香2,翁麗麗2*

(1.白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠(chǎng)，長(zhǎng)春 130012；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117)

摘要：目的建立人參發(fā)酵品中人參皂苷Rh1、Rg3的含量測(cè)定方法。方法采用高效液相色譜法測(cè)定，色譜條件：ODS色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；流動(dòng)相(Rh1)：乙腈-水(26.5∶73.5)，流動(dòng)相(Rg3)：乙腈-0.05%磷酸(37∶63)；柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min。結(jié)果人參皂苷Rh1的含量測(cè)定線(xiàn)性范圍0.1～1.1 μm，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，平均加樣回收率96.90%，RSD 2.67%。人參皂苷Rg3的含量測(cè)定線(xiàn)性范圍0.4～3.0 μm,相關(guān)系數(shù)為r=0.999 7,平均加樣回收率98.56%，RSD 2.51%。結(jié)論本方法檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果可靠。

關(guān)鍵詞：人參皂苷Rg3；人參皂苷Rh1；高效液相色譜法

人參為五加科植物人參的干燥根及根莖，具有大補(bǔ)元?dú)獾淖饔谩⑷藚⑴c大型擔(dān)子菌進(jìn)行雙向固體發(fā)酵，產(chǎn)生某些稀有皂苷，制得人參發(fā)酵產(chǎn)品。人參皂苷Rg3 及Rh1屬于稀有皂苷，具明顯的生理活性，因此建立人參皂苷Rg3 及Rh1的含量測(cè)定方法，對(duì)于人參藥材的開(kāi)發(fā)及綜合利用具有重要意義[1-5]。

1材料

1.1樣品人參發(fā)酵品，本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2試劑人參皂苷Rg3對(duì)照品及人參皂苷Rh1對(duì)照品(深圳市時(shí)得佳科技有限公司提供)；乙腈(色譜純)；甲醇、氯仿(分析純，北京化工廠(chǎng))。1.3儀器液相色譜儀(上海天美LC2000)，KQ3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2方法與結(jié)果

2.1人參皂苷Rg3的含量測(cè)定[6-10]

2.1.1色譜條件色譜柱Agilent-ODS柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸(37∶63)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備精密稱(chēng)取5 mg人參皂苷Rg3,置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備稱(chēng)取1 g人參發(fā)酵品，精密稱(chēng)定，置于錐形瓶中，加入50 mL甲醇，稱(chēng)重，超聲30 min，補(bǔ)足減失重量，過(guò)濾，精密吸取續(xù)濾液25 mL，蒸干；殘?jiān)尤?0 mL蒸餾水使其溶解，將已處理好的D101大孔吸附樹(shù)脂柱(1.5 cm×12 cm)預(yù)吸附1 h。先用蒸餾水100 mL洗脫，棄去洗脫液，再用50%甲醇50 mL洗脫，棄去洗脫液，最后用純甲醇100 mL洗脫，收集上述洗脫液并蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，稀釋至刻度。

2.1.4線(xiàn)性關(guān)系精密吸取對(duì)照品溶液2、5、7、10、13、15 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積積分值為橫坐標(biāo)X，以人參皂苷Rg3進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)Y(μg),計(jì)算其回歸方程為：Y= 536 128X+20 187，r=0.999 7，線(xiàn)性范圍0.4～3.0 μg。

2.1.5精密度試驗(yàn)量取10 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述色譜條件重復(fù)6次進(jìn)樣，得其峰面積，分別為1 131 620.375，1 144 992.500，1 083 006.375，1 115 813.750，1 111 352.250，1 121 389.002計(jì)算RSD值為1.87%。說(shuō)明儀器精密度良好。

2.1.6重現(xiàn)性試驗(yàn)按供試品溶液制備項(xiàng)下，獨(dú)立制備6份供試品溶液，按上述色譜條件，測(cè)得人參皂苷Rg3的含量，分別為0.65、0.63、0.6 mg/g，0.64、0.65、0.64 mg/g，平均值為0.645 mg/g，其RSD值為1.62%。說(shuō)明該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取人參皂苷Rg3對(duì)照品溶液、供試品溶液各1 μL，按上述色譜條件，每隔一段時(shí)間測(cè)定24 h內(nèi)峰面積值，結(jié)果人參皂苷Rg3對(duì)照品的RSD為1.72%，供試品的RSD為1.91%，表明人參皂苷Rg3在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8加樣回收率采用加標(biāo)回收法，精密稱(chēng)取同法測(cè)定的已知含量供試品，加入人參皂苷Rg3適量，按供試品溶液制備項(xiàng)下操作，以上述色譜條件進(jìn)行測(cè)試，計(jì)算回收率，結(jié)果測(cè)得平均回收率為98.56%，RSD為2.51%，表明此方法可行。2.1.9樣品測(cè)定取人參發(fā)酵品，按供試品溶液制備方法制得樣品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，根據(jù)峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上求出人參皂苷Rg3含量，再根據(jù)取樣量，計(jì)算得人參發(fā)酵品中人參皂苷Rg3的含量為0.6 mg/g。

2.2人參皂苷Rh1的含量測(cè)定[11-16]2.2.1色譜條件色譜柱Agilent-ODS柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，流動(dòng)相：乙腈-水(26.5∶73.5)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備精密稱(chēng)取5 mg人參皂苷Rh1，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，精密吸取4 mL該溶液，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3供試品溶液的制備精密稱(chēng)定4 g人參發(fā)酵品，置錐形瓶中，稱(chēng)重，精密加入50 mL水飽和正丁醇，超聲提取30 min，補(bǔ)足減失重量，過(guò)濾，精密吸取續(xù)濾液25 mL，加正丁醇飽和氨試液，提取3次，25 mL/次，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?氯仿(1∶1)溶解，揮干溶劑，上硅膠柱，用50 mL氯仿-甲醇(8.5∶1.5)溶液洗脫，收集洗脫液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓? mL容量瓶中定容，過(guò)濾，即得。

2.2.4線(xiàn)性關(guān)系精密吸取對(duì)照品溶液2、5、7、10、13、15 μL，按上述色譜條件測(cè)試，以峰面積的積分值為橫坐標(biāo)X，以人參皂苷Rh1的進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)Y(μg),計(jì)算其回歸方程為：Y= 72 280X-31 633,r= 0.999 8，線(xiàn)性范圍0.1～1.1 μg。

2.2.5精密度試驗(yàn)取10 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述色譜條件重復(fù)6次進(jìn)樣，得其峰面積，分別為498 964.656、494 852.500、483 920.125、503 192.500、498 521.000、491 630.000，計(jì)算其RSD值為1.25%。表明儀器精密度良好。

2.2.6重現(xiàn)性試驗(yàn)按供試品溶液制備，獨(dú)立制備人參發(fā)酵品供試品溶液6份，按上述色譜條件，測(cè)得人參皂苷Rh1含量，分別為0.054、0.05、0.055、0.053、0.053、0.055 mg/g，其RSD值為1.80%。表明方法重現(xiàn)性良好。

2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取人參皂苷Rh1對(duì)照品溶液10 μL、供試品溶液20 μL，按上述色譜條件，測(cè)定24 h內(nèi)峰面積值，結(jié)果對(duì)照品和供試品的RSD值為1.43%、0.76%，表明人參皂苷Rh1在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8加樣回收率采用加標(biāo)回收法，精密稱(chēng)取同法測(cè)定已知含量的人參發(fā)酵品，加入適量人參皂苷Rh1，按供試品溶液制備項(xiàng)下操作，以上述色譜條件測(cè)試，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為96.90%，表明本方法可行。

2.2.9樣品測(cè)定取人參發(fā)酵品，按供試品溶液制備項(xiàng)下制得樣品溶液，以上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算得人參發(fā)酵品中人參皂苷Rh1的含量為0.05 mg/g。

3小結(jié)

在測(cè)定人參皂苷Rg3時(shí)，以甲醇與水為流動(dòng)相，出現(xiàn)基線(xiàn)不平現(xiàn)象，故改用乙腈與水為流動(dòng)相；在選擇配比時(shí)，分別采用了乙腈-水48∶52、40∶60、39∶61、35∶65、37∶63，其中以乙腈-水37∶63分離效果最好，但是目標(biāo)峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，故改用乙腈-0.05%磷酸(37∶63)作為流動(dòng)相。

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Determination of content of Rg3 and Rh1 by HPLC method

WENG Yan1,WANG Xiaofei1,LIU Tongshuai2,BI Hua2,DONG Jinxiang2,WENG Lili2*

(1.The Pharmaceutical Factory,Norman Bethune Medical University,Changchun 130012,China;2.Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

Abstract：ObjectiveTo establish a method for the determination of the content of Rh1 and Rg3 in the ginseng fermentation product.MethodsHPLC,The chromatographic conditions： ODS chromatographic column (4.6 mm×250 mm,5 μm);detection wavelength 203 nm;mobile phase(Rh1):acetonitrile -water (26.5∶73.5),mobile phase (Rg3):acetonitrile -0.05% phosphoric acid (37∶63);Column temperature:30 ℃;flow rate was 1.0 mL/min.ResultsThe content of ginsenoside Rh1 was determined by linear range 0.1-1.1 μg,the correlation coefficient r=0.999 8,the average recovery was 96.90%,RSD2.67%.The content of ginsenoside Rg3 was determined by linear range 0.4-3 μg,the correlation coefficient was r=0.9997,the average recovery rate was 98.56%,RSD2.51%.ConclusionSensitivity of this method was high,and the detection results were reliable.

Keywords：ginsenoside Rg3;ginsenoside Rh1;HPLC

(收稿日期:2015-12-01)

文章編號(hào)：2095-6258(2016)02-0256-03

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

*通信作者：翁麗麗，電話(huà)-13039218920，電子信箱-735110462@qq.com

作者簡(jiǎn)介：翁硯(1979-)，女，工程師，主要從事藥物分析研究。

基金項(xiàng)目：吉林省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目(2014-ZD26)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.02.012