河南烤煙煙葉中糖苷類物質(zhì)的鑒定與分析

王 林,朱金峰,許自成*,王 遠(yuǎn),姚 倩,王蒙蒙,張景華

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院,河南 鄭州 450002;2.河南省煙草公司 漯河市公司,河南 漯河 462000)

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河南烤煙煙葉中糖苷類物質(zhì)的鑒定與分析

王 林1,朱金峰2,許自成1*,王 遠(yuǎn)1,姚 倩1,王蒙蒙1,張景華1

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院,河南 鄭州 450002;2.河南省煙草公司 漯河市公司,河南 漯河 462000)

摘要：采用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-ESI MS/MS)，分析鑒定了河南烤煙葉片中9種主要的糖苷類香味前體物質(zhì)。通過(guò)對(duì)液相色譜圖和質(zhì)譜圖進(jìn)行分析,推測(cè)9種糖苷類香味前體物質(zhì)分別為紫羅蘭醇-β-D-葡萄糖苷及其同分異構(gòu)體、新綠原酸及其同分異構(gòu)體、綠原酸及其同分異構(gòu)體、隱綠原酸、蕓香苷、山奈酚-3-蕓香糖苷,并分析了其相對(duì)含量。本研究結(jié)果為提高煙葉香氣品質(zhì)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：烤煙;葉片；糖苷類物質(zhì);鑒定

煙草中的香味成分對(duì)煙葉的品質(zhì)有重要的影響,其不僅以游離態(tài)存在,還以糖苷結(jié)合態(tài)形式存在,是香味成分的主要來(lái)源之一[1-4]。糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)是煙草重要的香味前體物質(zhì)[5-6],對(duì)煙葉香氣品質(zhì)有重要作用。糖苷類香味前體物質(zhì)本身一般不具備揮發(fā)性,但在煙葉烘烤和陳化過(guò)程中,糖苷鍵斷裂釋放出香味成分,從而對(duì)提升煙氣香味產(chǎn)生重要影響[7-10]。由于糖苷類香味前體物質(zhì)具有儲(chǔ)放穩(wěn)定性和釋香穩(wěn)定性等特點(diǎn),所以分析研究糖苷類香味前體物質(zhì)對(duì)卷煙調(diào)香工作有重要的意義。最近幾年,已有大量有關(guān)煙葉化學(xué)成分鑒定的綜述性報(bào)道,有關(guān)煙葉糖苷類化合物也有一些深入研究,主要集中在煙草糖苷類化合物作為香味前體所發(fā)生的作用[11-13]。

糖苷的種類繁多,要獲得完整的標(biāo)樣存在一定的困難,高效的純化、分離技術(shù)不完善,使得系統(tǒng)地分離、鑒定煙草糖苷類化合物較為困難。多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可以提供被分析成分的結(jié)構(gòu)信息,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)目前已被應(yīng)用于植物有效成分的分離與結(jié)構(gòu)分析鑒定實(shí)驗(yàn)。本文選取河南烤煙煙葉樣品,對(duì)河南烤煙煙葉中的糖苷類化學(xué)成分進(jìn)行了鑒定分析,旨在為提高河南烤煙香氣品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料和儀器

試劑和樣品：甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨(色譜純)、Mill-Q超純水;其它有機(jī)試劑均為分析純。烤煙煙葉C2F于2014年8月30日采自河南省漯河市煙草公司的復(fù)烤煙葉。

儀器：美國(guó)Agilent 1100 Series LC/MSD Trap XCT液質(zhì)聯(lián)用儀;超聲波清洗器(SK 25M86A023,美國(guó)Ku-DOS); Clams500四級(jí)桿質(zhì)譜儀(美國(guó)PE公司); API3200QTRAP串聯(lián)三重四級(jí)桿線性離子阱質(zhì)譜儀(美國(guó)AB公司);超純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

1.2方法

1.2.1提取與分離

1.2.1.1糖苷類香味前體物質(zhì)的分離準(zhǔn)確稱取10 g煙樣(過(guò)80目篩)于錐形瓶中,加100 mL的甲醇，超聲萃取1 h；將萃取液過(guò)濾,對(duì)殘?jiān)偌尤?00 mL的甲醇，超聲萃取1 h；合并兩次萃取液,萃取液過(guò)濾濃縮至干(真空泵35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干),加100 mL的水，溶解后過(guò)XAD-2柱;先用400 mL的水洗去酸、堿和糖,再用300 mL乙醚-正己烷(體積比為1 ∶1,各150 mL)洗去游離的香味物質(zhì)和油脂、蠟質(zhì)成分,最后用300 mL甲醇將糖苷洗脫下來(lái);將甲醇洗脫液減壓濃縮至干(真空泵旋轉(zhuǎn)蒸干),得到初步純化的糖苷。

1.2.1.2UPLC-MS/MS分析樣品將1.2.1.1中所得到的初步純化的糖苷用甲醇定容到25 mL,取上清液1 mL，過(guò)0.22 μm的濾膜,濾液供UPLC-MS/MS分析。

1.2.2UPLC-MS/MS分析條件

1.2.2.1色譜條件Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流速1.0 mL/min；柱溫為室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量5 μL。流動(dòng)相: A相為0.1%甲酸-甲酸銨水溶液；B相為甲醇；C相為乙腈。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1　梯度洗脫程序

1.2.2.2質(zhì)譜條件ESI離子源,毛細(xì)管電壓3500 V,干燥氣溫度350 ℃,干燥氣流速10.0 L/min,霧化氣壓力50.0 psi。

2結(jié)果與分析

2.1河南烤煙糖苷類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)推測(cè)

在本實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)電噴霧一級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行母離子全掃描(Q1),發(fā)現(xiàn)糖苷母離子以[M-H]-和[M+H]+兩種形式存在。對(duì)所采集樣品的液相色譜圖上的9個(gè)色譜峰進(jìn)行了解析歸屬。而這9個(gè)色譜峰所一一對(duì)應(yīng)的液相色譜圖和質(zhì)譜圖的保留時(shí)間如表2所示。

2.2河南烤煙糖苷類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析

對(duì)于峰1和峰2，推測(cè)應(yīng)為紫羅蘭醇-β-D-葡萄糖苷及其同分異構(gòu)體[14-15]。這是因?yàn)檎x子模式的質(zhì)譜圖均有m/z 163、179、311、357等,負(fù)離子模式的質(zhì)譜圖均有m/z 309、355、405、425等(見(jiàn)圖1),所以推測(cè)應(yīng)為同分異構(gòu)體。在質(zhì)譜圖上有分子離子m/z 355([M-H]-)、m/z 357([M+H]+),故推測(cè)該物質(zhì)的分子量應(yīng)為356；根據(jù)參考文獻(xiàn)，推測(cè)可能為α-紫羅蘭醇-β-D-葡萄糖苷和β-紫羅蘭醇-β-D-葡萄糖苷,其中分子離子m/z 163表明丟失了整個(gè)糖苷配基。

表2　河南烤煙糖苷類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)推測(cè)

圖1　峰1和峰2的全掃描質(zhì)譜圖

峰3、4、5、6、7的質(zhì)譜圖信息如圖2～圖3所示。從一級(jí)質(zhì)譜圖可以看出均有準(zhǔn)分子離子m/z 353([M-H]-),推測(cè)為綠原酸及其4種同分異構(gòu)體,但目前文獻(xiàn)報(bào)道綠原酸只存在3種同分異構(gòu)體(綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸)[16-17],所以還需進(jìn)行進(jìn)一步的考究確證。從二級(jí)質(zhì)譜圖中可以看出,峰3和峰4有m/z 191、179、173、135,峰5和峰6有m/z 191、179,峰7有m/z 191、179、173、135,峰3、4和7雖然含有相同的碎片離子,但是對(duì)應(yīng)的相對(duì)豐度差別很大。由此推測(cè)峰3和峰4為新綠原酸及其同分異構(gòu)體,峰5和峰6為綠原酸及其同分異構(gòu)體,峰7為隱綠原酸。

圖2　峰3、4、5、6、7的全掃描質(zhì)譜圖

圖3　峰3、4、5、6、7的MS2全掃描質(zhì)譜圖

對(duì)于峰8，推測(cè)應(yīng)為蕓香苷。在負(fù)離子掃描的一級(jí)質(zhì)譜圖上有準(zhǔn)分子離子m/z 609([M-H]-),將其打碎進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析,出現(xiàn)的碎片中豐度較高的是m/z 301。在正離子掃描的一級(jí)質(zhì)譜圖上有準(zhǔn)分子離子m/z 611([M+H]+),將其打碎進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析,出現(xiàn)的碎片中豐度較高的是m/z 303。結(jié)合正、負(fù)離子模式的二級(jí)質(zhì)譜圖,推斷該碎片分子量為302,為蕓香苷失去蕓香糖苷所得的黃酮苷元(見(jiàn)圖4～圖6)。

圖4　峰8的全掃描質(zhì)譜圖

圖5　峰8的MS2全掃描質(zhì)譜圖

對(duì)于峰9，推測(cè)應(yīng)為山奈酚-3-蕓香糖苷。在一級(jí)質(zhì)譜圖上分別有m/z 593([M-H]-)、595([M+H]+)。在二級(jí)質(zhì)譜圖上,丟失蕓香糖苷,出現(xiàn)山奈酚的準(zhǔn)分子離子峰m/z 285([M-H]-)、287([M+H]+)(見(jiàn)圖7～圖9)。

2.3河南烤煙糖苷類物質(zhì)的含量分析

通過(guò)高效液相色譜的定量分析,對(duì)河南煙葉中推測(cè)的9種糖苷類物質(zhì)的相對(duì)含量進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果如表3。從表3中得知,蕓香苷的相對(duì)含量最高,紫羅蘭醇-β-D-葡萄糖苷的相對(duì)含量次之,新綠原酸和隱綠原酸的含量最低。高效液相色譜法的定量測(cè)定結(jié)果為今后糖苷類物質(zhì)的測(cè)定提供了依據(jù)。可通過(guò)對(duì)糖苷類物質(zhì)的含量進(jìn)行比較,分析不同實(shí)驗(yàn)處理對(duì)糖苷類物質(zhì)含量的影響,從而為提高煙葉糖苷類物質(zhì)的含量提供指導(dǎo)。

圖6　蕓香苷的裂解途徑

圖7　峰9的全掃描質(zhì)譜圖

圖8　峰9的MS2全掃描質(zhì)譜圖

圖9　山奈酚-3-蕓香糖苷的裂解途徑

3小結(jié)與討論

本文采用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析法定性和定量地分析鑒定了河南烤煙煙葉中的糖苷類化學(xué)成分。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,通過(guò)電噴霧質(zhì)譜對(duì)母離子進(jìn)行了掃描,并對(duì)多級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行了分析,推測(cè)出9種糖苷類前體物質(zhì)為紫羅蘭醇-β-D-葡萄糖苷及其同分異構(gòu)體、新綠原酸及其同分異構(gòu)體、綠原酸及其同分異構(gòu)體、隱綠原酸、蕓香苷、山奈酚-3-蕓香糖苷。該方法為不同煙草中糖苷類物質(zhì)的分析鑒定提供了一定的理論依據(jù)。

表3　河南烤煙糖苷類物質(zhì)的相對(duì)含量

煙草的香氣受不同狀態(tài)、不同類別香氣成分的組成和比例的影響。現(xiàn)今研究多集中在對(duì)游離態(tài)香氣物質(zhì)的研究上[18-19],而大量糖苷類物質(zhì)在陳化燃燒過(guò)程中釋放的香氣對(duì)煙葉香氣的提高有突出的貢獻(xiàn)[20-22]。有關(guān)學(xué)者多采用氣相色譜法分析糖苷類前體物質(zhì)分解釋放的小分子物質(zhì)對(duì)煙葉香氣的影響[23-25],所得結(jié)果的可靠性可能受游離態(tài)香氣物質(zhì)含量的影響而降低。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)煙草中糖苷類物質(zhì)的相對(duì)含量進(jìn)行了直接分析,這為今后開(kāi)展提高煙草中糖苷類物質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)提供了有效的途徑。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Identification and Analysis of Glycosidic Substances from Flue-cured Tobacco Leaves in Henan Province

WANG Lin1, ZHU Jin-feng2, XU Zi-cheng1*, WANG Yuan1,YAO Qian1, WANG Meng-meng1, ZHANG Jing-hua1

(1. College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;2. Luohe Branch of Henan Provincial Tobacco Company, Luohe 462000, China)

Abstract：Nine main glycosidic flavor precursors from flue-cured tobacco leaves grown in Henan Province were identified and analyzed by using ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (UPLC-ESI-MS/MS). The chemical structures of 9 main glycosidic flavor precursors were determined by analysis of the liquid chromatography and mass spectrogram, they were ionol-β-D-glucopyranoside and its structural isomer, chlorogenic acid and its structural isomer, neochlorogenic acid and its structural isomer, cryptochlorogenic acid, rutin, kaempferol-3-rutin, respectively, and their content were determined. This research provided a theoretical basis for improving aroma quality of tobacco leaves.

Key words：Flue-cured tobacco; Leaf; Glycosidic substances; Identification

中圖分類號(hào)：S572.01

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-8581(2016)02-0049-05

作者簡(jiǎn)介：王林(1992─),女,河南安陽(yáng)人,碩士研究生,主要從事煙草栽培與質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。*通訊作者:許自成。

基金項(xiàng)目：河南省煙草公司科技攻關(guān)項(xiàng)目(HYKJ 201105、HYKJ 201043)。

收稿日期：2015-07-09