地中海貧血診斷方法研究進展

劉宜平，馮建軍，尹維，舒向華，呂連華 ，王永碧

(1.綿陽市中心醫院；2.綿陽市人民醫院，四川 綿陽　621700)

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地中海貧血診斷方法研究進展

劉宜平1，馮建軍2，尹維2，舒向華2，呂連華2，王永碧2

(1.綿陽市中心醫院；2.綿陽市人民醫院，四川 綿陽621700)

目的：地中海貧血實驗室診斷技術主要包括血液學篩查及基因檢測兩大類。前者主要以紅細胞形態及其理化特性為診斷依據，包括紅細胞形態分析、血常規分析、紅細胞滲透脆性試驗、血紅蛋白組分分析等；后者主要是以PCR為基礎的各種基因檢測技術來進行診斷，包括Southern印跡雜交、PCR反向點雜交法、實時熒光PCR的探針溶解曲線分析、基因芯片、DNA測序等。本文就近年來地中海貧血的部分診斷方法及其研究進展作一綜述。

地中海貧血；診斷方法；篩查試驗；基因檢測

地中海貧血(thalassemia)，即珠蛋白生成障礙性貧血，是一組由珠蛋白基因缺失或點突變致使珠蛋白肽鏈合成部分或完全抑制的遺傳性溶血性貧血疾病。臨床表現根據病情嚴重程度不同而有所差異，患者主要以貧血、黃疸、肝脾腫大為突出表現。珠蛋白肽鏈分為α、β、γ、δ四種，而地中海貧血主要有α、β、δβ、δ四種類型，以前兩種(α、β地中海貧血)最常見。

1　中海貧血發病率及分子基礎

地中海貧血廣泛分布于東南亞地區、地中海區域及少數非洲國家，我國南方如廣東、廣西、四川、云南、海南、福建、香港、臺灣等地多見。每年全世界至少有33萬新生兒患鏈狀細胞貧血和地中海貧血，并且大約7%的孕婦攜帶地中海貧血基因[1]。李穎豐等[2]對我國23 809例育齡人群進行地中海貧血初篩,其陽性率為21.61%,初篩陽性者再行血紅蛋白電泳發現可疑α地貧比率約14.80%、可疑β地貧6.82%，最后基因檢測確診α地貧基因攜帶率10.23%,β地貧基因攜帶率6.27%。國際上公認對高風險孕婦進行產前篩查能減少重型地中海貧血嬰兒出生[3-4]。

α珠蛋白基因位于16P13.3，α地中海貧血可分為基因缺失型(多為缺失1個或2個α珠蛋白基因)和非基因缺失型(主要為α珠蛋白基因發生點突變或少數堿基缺失)。全世界已經發現40余種基因缺失可致α地中海貧血，其大多數為α0地中海貧血(即單倍體中2個α基因的mRNA都完全缺失，又名為α地中海貧血1)；少數為α+地中海貧血(即單倍體中1個α基因的mRNA部分缺失，又名α地中海貧血2)。我國已發現7種缺失型地中海貧血(即4種α0地中海貧血：-SEA、-THAI、-FL、-HW)和3種α+地中海貧血(-α3.7、-α4.2、-α2.7)。

其中我國以東南亞缺失型α地中海貧血—SEA、右側缺失-α3.7、左側缺失-α4.2最為常見。全世界共發現40余種非缺失型α地中海貧血，我國以HbCS和HbQS最常見。

β珠蛋白基因位于11P15.3,引起β地中海貧血的基因突變也可分為缺失型突變與非缺失型突變，大多數β地中海貧血屬于非缺失型突變(點突變或者少數幾個堿基缺失及插入)。全世界已發現200余種缺失型β地中海貧血，我國目前有30余種，其表型分為β0(即無β珠蛋白產生)和β+(有較低水平β珠蛋白產生)。輕型β地中海貧血為雜合子，重型β地中海貧血為β0或β+純合子以及β0與β+的雙重雜合子，中間型分子基因則較復雜多變。β地中海貧血的臨床表現也因其基因組合的不同而各不相同。我國最常見β地中海貧血基因突變有：CD41-42(-CTTT)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、-28(A>G)、CD26(C>A)(HbE)、CD17(A>T)、CD71/72(+A),以上在我國南方地區人群基因頻率超過90%[5-6]。

2　地中海貧血常用的診斷方法

地中海貧血實驗室診斷技術主要包括血液學篩查及基因檢測兩大類。前者簡便經濟，故常用于大規模普查以及基層衛生機構的篩查；后者雖然操作復雜且費用較貴，但卻能夠更加精準地診斷地中海貧血。目前篩查試驗包括紅細胞形態分析、血細胞分析、紅細胞滲透脆性試驗、血紅蛋白組分分析等；而基因檢測則主要包括Southern印跡雜交(Southern blot)、多重PCR、多重斷裂點PCR、PCR反向點雜交法(PCR-RDB)、實時熒光PCR的探針溶解曲線分析(PMCA)、基因芯片、DNA測序、等位基因特異性擴增技術(ARMS)、變向梯度膠凝電泳(DGGE)、巢式PCR、PCR限制內切酶譜分析(PCR-RFLP)、單鏈構向多態性PCR(PCR-SSCP)。另外，產前診斷也是地中海貧血預防控制的一個重要環節。

2.1篩查試驗

2.1.1紅細胞形態分析地中海貧血患者血涂片檢查示紅細胞大小不均，常可見形態不規則的異形紅細胞:如嗜堿性點彩紅細胞、淚滴形紅細胞、靶形紅細胞等。其中靶形紅細胞最多見，此種紅細胞中央部位染色較深，周圍區域蒼白，而細胞邊緣處又深染，形如射擊之靶，當出現靶形紅細胞時需高度警惕地中海貧血。

2.1.2血細胞分析紅細胞基本參數是臨床初步篩查地中海貧血最簡單經濟的常用指標[7]。紅細胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)、紅細胞壓積(HCT)、紅細胞平均體積(MCV)、紅細胞平均血紅蛋白量(MCH)、紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細胞體積分布寬度(RDW)等參數都有助于地中海貧血的診斷。其紅細胞呈典型小細胞、低色素性且大多紅細胞內可見包涵體，國際地中海貧血協會推薦將MCV<78 fl、MCH<27 Pg作為篩查地中海貧血的截斷值[8]。同時其余參數如RBC、Hb、HCT、MCHC、RDW也均有不同程度的改變，且網織紅細胞比例常高于正常人。

2.1.3紅細胞滲透脆性實驗紅細胞滲透脆性實驗可檢測在不同低滲透壓鹽水中紅細胞的抵抗力。地中海貧血患者紅細胞存在不同程度變形且體積變小，其表面積與體積的比值增大，故在低滲鹽水中吸水膨脹的適應性較大(脆性降低)。但是紅細胞滲透脆性實驗并不能單獨用于地中海貧血的診斷，必須將它和上述多種指標聯合起來進行檢測分析才能初步診斷地中海貧血。有學者將MCV、RDW以及紅細胞滲透脆性實驗聯合起來用于地中海貧血的檢測，可大大提高篩查的靈敏度和特異度，甚至能初步和缺鐵性貧血進行鑒別[9]。

2.1.4血紅蛋白組分析對血紅蛋白進行分離鑒定和定量分析是診斷地中海貧血快速可靠的方法。血紅蛋白組分分析能夠定量檢測HbA、HbA2、HbF、HbH、HbBart，s等，常用的分析方法有：(1)普通血紅蛋白電泳法：因PH8.5緩沖鹽液中各種Hb等位點均<7，在電場作用下不同的血紅蛋白以不同的速度向陽極移動，常用醋酸纖維素薄膜作為支撐物來定量分析血紅蛋白[10]。(2)瓊脂糖凝膠電泳：堿性環境下血紅蛋白在電場中分離后染色,可對血紅蛋白瓊脂糖定量。(3)高效液相色譜：利用離子交換樹脂作為固定相，高壓下血紅蛋白理化不同，故在分離柱停留時間不等，從而將血紅蛋白分離出來。其中，高效液相色譜分析技術對β地中海貧血、Hb變異體、Hb A及Hb F篩查的敏感度及精確度尤其高[11-12]。

目前，國際地中海貧血協會推薦將HbA2的含量檢測作為β-地中海貧血攜帶者診斷標準，因高效液相色譜可以同時對HbA2進行定量分析，故廣泛應用于β-地中海貧血攜帶者的篩查。(4)毛細管電泳：血紅蛋白經過毛細管分離通道，在電場中可以定向移動，不同血紅蛋白移動速度不同，以此來分離各種血紅蛋白并且可直接對血紅蛋白進行定量分析，已逐漸在臨床廣泛應用。有報道稱毛細管電泳綜合了高效液相色譜和凝膠電泳的共同優點，具備高效、高靈敏度、可重復性等優點[13]。

普通血紅蛋白電泳法及瓊脂糖凝膠電泳因操作簡單、成本低廉，故常用于基層醫院地中海貧血的常規篩查；而毛細管電泳及高效液相色譜可以進一步完善前兩者方法的不足，但因其成本高并且對質控要求也較高，故常用于大型實驗室。

2.2基因檢測

多年的研究證實，地中海貧血是由于珠蛋白基因的缺失或點突變引起的珠蛋白鏈合成障礙，故針對突變基因的檢測能夠更加準確地診斷該病。早在1976年，已提出利用DNA-DNA核糖雜交技術檢測α珠蛋白的基因，標志著基因分子診斷的誕生。隨著1985年具劃時代意義的聚合酶鏈反應(PCR)技術的發明以及近幾十年來PCR相關技術的不斷完善，地中海貧血的基因診斷技術得到極大的發展并成為其診斷的金標準。

2.2.1Southern印跡雜交該方法的原理是提取基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳分離經限制性內切酶消化的DNA片段，再轉移到硝酸纖維膜上，最后與放射性核素標記的DNA或RNA探針雜交，用放射自顯影檢測酶解DNA片段的大小和位置。該方法操作所需樣本量大且步驟繁瑣，故其在臨床中的應用受到限制。但需要提及的是Southern 印跡雜交是分析大片段缺失特別是α珠蛋白基因缺陷的金標準，常作為其他基因診斷及PCR產前診斷結果的確診試驗[14]。

2.2.2多重PCR及多重斷裂點PCR(多重gap-PCR)PCR原理即利用DNA聚合酶對引物進行延伸，經變形、退火、延伸過程實現特定DNA片段的體外擴增。該方法操作簡便，適合基層醫院對地中海貧血的臨床診斷。近年來，科學家們在PCR基礎上發展出多重PCR，即在同一PCR反應體系里加上兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段。這樣可以根據每個突變點特異性擴增產物來判斷結果，大大提高缺失型α地中海貧血篩查(如東南亞缺失-SEA、左缺失-α4.2、右缺失-α3.7)及靜止性α地中海貧血診斷。

多重斷裂點PCR(多重gap-PCR)的原理是在基因缺失區域內設計兩到三對引物，根據PCR特異性擴增片段有無來判斷基因型，同時還可根據陽性擴增片段及正常 對照片段來綜合診斷被檢者是地中海貧血純合子還是雜合子或者是正常人。目前，該方法是國內外診斷α地中海貧血基因缺失最常用的方法，較多實驗室用JfI跨越缺失基岡斷裂點序列的Gap-PCR對缺失型α和β地中海貧血進行基因診斷[15]。

2.2.3PCR-反向點雜交法(PCR-RDB)原理是將一系列已知寡核苷酸探針固定于支持膜上，加入PCR產物進行液相探針雜交，可同時檢測多種點突變。因該法快速、準確、所需樣本量少，故已成為國內外實驗室最常用的地中海貧血點突變檢測方法，尤其適用于β地中海貧血點突變的檢測[16]。但該法操作繁雜且易形成主觀判斷上的失誤，故對實驗室技術人員的技能要求較高，同時，如遇可疑結果須重復檢測。

2.2.4實時熒光PCR的探針溶解曲線分析(PMCA)原理是運用實時熒光檢測技術結合探針溶解曲線分析技術，在異常擴增后檢測PCR產物多色熒光溶解曲線從而鑒定多種突變[17]。我國學者嚴提珍等[18]分別采用PMCA方法與PCR-RDB方法對451份外周血標本和84份胎兒絨毛、羊水、臍帶血產前診斷標本進行檢測，并用DNA測序法進行驗證，結果發現前者比后者有更高的基因診斷符合率，能夠更準確地檢測出多種基因突變類型。但該方法還處于完善階段，對技術要求高，操作復雜且費用昂貴，故僅在少數幾個大型臨床實驗室中開展，暫時未能在臨床工作中大規模應用。

2.2.5基因芯片原理是通過微加工及微電子技術，在固相介質(如玻片、塑料、硅片、聚丙烯酰胺凝膠等)上固定序列已知的核苷酸探針，與已被熒光素或同位素標記的核酸序列進行雜交,可通過激光共聚焦顯微鏡上反應點的熒光強弱及位置，獲得一組序列完整互補的探針序列，重組出靶核酸的序列[19]。其優點是高效、靈敏、快速，可短時間同時檢測多種基因突變，但是成本昂貴，目前尚未在臨床診斷中大規模應用。

2.2.6DNA測序方法是將標本DNA經PCR擴增后，在DNA自動測序儀上進行序列分析。常用于當其他基因檢測法與臨床表型不符合時的進一步驗證，或者是分析未知基因突變時選用的檢測方法。該方法是判斷基因點突變類型及位置的金標準，但是該法對實驗設備及標本DNA濃度要求較高并且所需時間較長，目前多在實驗室中應用。

2.2.7其他方法其他基因檢測方法較多，如等位基因特異性擴增技術(ARMS)適合針對某種小片段突變類型的特定檢測；變性梯度凝膠電泳(DGGE)費用低廉，適合大規模的未知突變基因篩查；巢式PCR(又名套內PCR)是胚胎植入前常用的基因診斷方法；PCR限制性內切酶譜分析(PCR-SSCP)常用來檢測未知基因突變，但影響結果的因素較多，不能用于大片段基因(超過400堿基)的檢測。

2.3胎兒產前診斷

目前胎兒產前診斷主要有胎兒基因診斷和超聲檢查。

2.3.1胎兒基因診斷胎兒基因診斷分為有創及無創性胎兒基因檢查。何升等對1 072例高風險孕婦孕10～15周絨毛樣本進行地貧基因檢測，在產前診斷后1周內終止妊娠能有效避免重型地中海貧血患兒出生[20]。但通過穿刺手段采集絨毛、羊水等易對胎兒造成傷害，增加流產、宮內感染等風險。

1997年，Lo等[21]的研究發現妊娠母體血漿中存在胎兒的遺傳物質，通過對胎兒遺傳物質進行檢測診斷能夠避免有創檢查帶來的風險，更加安全。經過科學家們長時間的研究，無創性基因檢測在2008年有了突破性進展，Galbiati等[22]利用PNA鉗夾以微電子芯片技術檢測孕婦血漿中游離的胎兒β珠蛋白基因突變，檢測準確度為100%，特異性為98.3%。近年，對母體血漿中游離DNA的定量檢測技術有了新的進展，利用母體血漿cff-DNA的二代測序技術，可對基因組范圍的目標序列進行定量分析從而進行無創產前檢測。我國開發了一種基于孕婦血漿DNA目標區域高深度測序，對可能攜帶致病性拷貝數變異(CNVs)的胎兒樣本進行無創產前基因檢測的方法，通過該方法，研究人員可以準確檢測出胎兒是否患有地中海貧血[23]。相信在未來通過進一步的探索和完善，無創產前基因診斷能夠更好地運用到臨床工作中。

2.3.2產前超聲檢查產前超聲檢查具有安全、無創、簡便、可重復等優點，報道顯示其對地中海貧血組胎兒的正確診斷率可達92.3%。通過超聲檢測胎兒水腫成為重型地中海貧血產前篩查和診斷的常用方法，可作為基層醫院地中海貧血產前診斷的選擇[24]。

3　小結

在眾多地中海貧血篩查及基因檢測中，如何選擇合適的檢測方法需要血液學工作者們綜合考慮地區人群特點、當地經濟情況、技術水平等來最終決定。篩查方法須聯合測定并綜合分析；基因檢測要按照國內外地中海貧血實驗室操作指南[5,25]來操作，基因分型必須用兩種不同原理的方法進行確診。在我國α地中海貧血主要為缺失突變，β地中海貧血主要為點突變。故診斷前者優先選用缺失突變檢測方法，如Gap-PCR、Southern blot等；后者優先選用點突變檢測方法，如PCR-RDB、基因芯片、實時PCR基因分型等。對于“已知”突變診斷方法較多，如Gap-PCR、Southern blot、PCR-RDB等；對于“未知”突變，常用PCR-SSCP、變相高效液相色譜(DHPLC)等先將“未知”突變基因篩查出來，再用DNA測序分析這些“未知”基因。地中海貧血是發病率較高的遺傳性疾病，除骨髓移植外，尚無較好的治療方法。地中海貧血患者給社會及家庭帶來巨大負擔，故產前診斷對于預防地中海貧血患兒的出生非常重要，特別是在高發地區廣泛開展地中海貧血患者及攜帶者篩查及診斷對提高該地區人口素質及降低地中海貧血發生率具有積極深遠的意義。

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(學術編輯：魏錦)

Advances in diagnostic methods thalassemia

LIU Yi-ping1,FENG Jian-jun2,YIN Wei2,SHU Xiang-hua2,LV Lian-hua2，WANG Yong-bi2

(1.Mianyang Central Hospital;2.The People’s Hospital of Mianyang,Mianyang 621700,Sichuan,China)

【Abstract】Objective：Mediterranean Laboratory Diagnostic Techniques include screening test and genetic testing；the former diagnosis method is mainly based on the morphology of red blood cells and the physical and chemical properties,including forms of red blood cells,red blood cell permeability test,erythrocyte osmotic test,hemoglobin component analysis,high performance liquid chromatography (HPLC),etc.The latter is mainly based on various of molecular biology experiments developed on the basis of PCR,including Southern blot hybridization (Southern blot),PCR reverse dot blot hybridization (PCR-RDB),analysis of real-time fluorescent PCR probe dissolution curve (PMCA),gene chip and DNA sequencing,etc.In this paper some methods of diagnosis of the Mediterranean anemia are to be reviewed.

Thalassemia;Diagnostic methods;Screening test;Genetic testing

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.04.049綜述

四川省衛生廳科技項目(120315)；四川省綿陽市科技局項目支持(12c006-10)

2015-12-12

劉宜平(1977-)，女 ，碩士，主治醫生。

馮建軍，E-mail：fjj0806@126.com

網絡出版時間：2016-8-217∶48網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160802.1748.098.html

1005-3697(2016)04-0622-04

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