土壤及作物中重金屬生物可給性的體外模擬研究進展

黃玲　長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025

環(huán)境保護部華南環(huán)境科學研究所,廣東 廣州 510655

周存宇

(長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025)

陳志良

(環(huán)境保護部華南環(huán)境科學研究所,廣東 廣州 510655)

張景書

(廣東省佛山市南海環(huán)境科學研究所，廣東 廣州 528200)

蘇耀明，彭曉春

(環(huán)境保護部華南環(huán)境科學研究所,廣東 廣州 510655)

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土壤及作物中重金屬生物可給性的體外模擬研究進展

黃玲長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025

環(huán)境保護部華南環(huán)境科學研究所,廣東 廣州 510655

周存宇

(長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025)

陳志良

(環(huán)境保護部華南環(huán)境科學研究所,廣東 廣州 510655)

張景書

(廣東省佛山市南海環(huán)境科學研究所，廣東 廣州 528200)

蘇耀明，彭曉春

(環(huán)境保護部華南環(huán)境科學研究所,廣東 廣州 510655)

[摘要]通過體外模擬方法從生物可給性方面來評價重金屬對人體健康的危害程度已逐漸成為研究熱點。在闡述生物可給性概念的基礎上，重點綜述了in vitro消化方法的生理基礎和實驗操作及其在評價重金屬生物可給性方面實際運用的國內外研究進展。最后指出了in vitro模擬腸胃方法存在的問題，并對其應用前景作了展望。

[關鍵詞]重金屬；生物可給性；體外模擬

近年來土壤重金屬污染的健康風險研究，從以前大多研究重金屬通過食物鏈進入人體的重金屬總量研究，逐漸轉向重金屬進入機體的有效性的健康風險研究[1,2]。與重金屬總量相比,生物有效性能夠更準確地評價污染物的危害風險和營養(yǎng)物質的吸收利用情況。生物有效性(bioavailability),是指被人體吸收后進入血液,然后在體內重新分布的污染物或營養(yǎng)物的含量[3]。生物有效性一般通過活體實驗(invivo)進行評價,結果一般相對較為準確和可靠,但受實驗周期長、動物個體間差異等不可控因素的影響較大[4],而且由于動物和人體生理上的差異,動物體的實驗結果有時不能很好地解釋人體吸收情況。而逐漸發(fā)展起來的體外實驗(invitro)方法可以得到物質的生物可給性(bioaccessibility),并且能夠在一定程度上評價生物體對物質的吸收狀況。

Invitro方法以體外消化法為主,體外消化法也被稱為人工模擬胃腸法。生物可給性是指在模擬的人工腸胃系統(tǒng)中,可能被血液系統(tǒng)吸收的污染物或營養(yǎng)物的含量[3],是物質被生物可能吸收的最大值。國際上多采用體外模擬法進行重金屬經(jīng)口攝入的研究[5～7]，但國內在此方面研究尚不多見，可見我國在該研究方向還具有較大的發(fā)展空間。

1In vitro方法

1.1實驗過程

Invitro體外消化方法主要是通過模擬食物在消化道中消化過程的各種反應，評價食物中營養(yǎng)物或污染物的生物可給性，從而為進一步分析物質的生物有效性提供依據(jù)。Invitro模擬胃腸的方法主要有溶解法和透析法。

1)溶解法模擬胃腸反應的環(huán)境溫度37℃,固液比在1∶2到1∶150之間，用震蕩、離心或機械攪動來模擬胃腸的蠕動，同時通入氬氣模擬胃腸的厭氧環(huán)境；樣品應在pH1～4的胃酸和胃蛋白酶(濃度在1.25～10mg·mL-1，在稀鹽酸中溶解)的環(huán)境中保存1～4h；冰浴10min以停止胃階段反應。小腸階段,首先用NaOH或Na2CO3將pH調至4～8,然后加入多種酶組成的小腸液,主要是胰液素和膽鹽(一般50mL0.1mg·mL-1的Na2CO3中含有0.2mg胰酶和1.25g膽鹽)[8]。胰液素是脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶的混合物,膽鹽的加入能夠消化脂肪并幫助小腸的吸收。在模擬腸蠕動過程中需檢測pH的變化,并在4～7h的腸階段中保持穩(wěn)定。

2)透析法用透析袋(允許分子量小于10～12000u的物質通過)將腸胃消化液和緩沖液隔離開。透析袋內的緩沖液含有NaHCO3,調整NaHCO3的量使其與外部消化液的酸被中和后溶液pH達到7.5。反應進行45min后,加入胰酶膽鹽混合物,然后繼續(xù)培育2h。結束后，將透析袋取出清洗。有研究者比較這2種檢測方法發(fā)現(xiàn)，溶解法的測定結果與元素總量相關性較好，而透析法的結果與總量無明顯相關性，僅受元素種類的影響[9]。一般情況下，透析量小于溶解量。

1.2實驗方法的驗證

Invitro人工模擬腸胃的評價方法能夠很好地擬合invivo方法的實驗結果。如Juhasz等[10]認為Invitro方法得出的砷的生物可給性可以估計其生物有效性。Grin等[11]用invitro方法測定土壤中PHA的相對生物可給量與動物體內invivo實驗得出的相對生物有效量也呈線性相關。Invitro消化系統(tǒng)是由對Fe和其他礦物質的生物可給性的測定發(fā)展而來的。首先廣泛應用于重金屬的生物可給性，如無意口部攝入的土壤中的鉛和砷對人體鉛和砷總量的貢獻率大大增加(尤其是兒童)[12]。Invitro人工模擬胃腸方法能夠控制各種物理化學條件，包括溫度、機械攪拌、pH和消化酶，與人體消化過程相似。用生物可給性代替污染物總量進行風險評價將大大提高結果的準確性[13]。由于準確度較高、成本較低，Invitro人工模擬腸胃的方法被廣泛地用于各種生物可給性的測定。

2In vitro法在國內外的實際應用研究

2.1土壤中重金屬的生物可給性研究

評估土壤中重金屬的生物可給性，通常有2種方法，即動物實驗和體外實驗(invitro)。大量研究表明，基于生理學的體外實驗較動物實驗簡單、快捷、易控、重現(xiàn)性好，而且還能提供不同生理過程中重金屬的可給性數(shù)據(jù)。Juhasz等[14]采用以豬為受試對象的活體法和簡化的體外法研究了污染土壤中As的生物可給性，結果顯示這2種方法具有非常好的相關性，因此可以用體外法替代活體法來預測重金屬的生物可給性。

唐翔宇等[15]采用體外模擬法研究了安徽省阜陽市肖口鎮(zhèn)居民區(qū)附近的黃褐土中Pb的生物可給性，發(fā)現(xiàn)Pb在胃階段的生物可給性遠高于小腸階段的可給性，而且羥基磷灰石的加入能非常有效地降低土壤Pb在人體(主要是小腸)內的吸收量。付瑾等[16]采用體外模擬法對湖南和內蒙古采集的Pb、Cd和Sn污染的土壤進行研究，發(fā)現(xiàn)胃階段Pb的生物可給性顯著高于腸階段；Cd的生物可給性在胃腸之間的差異與腸階段pH 有關；Sn的生物可給性在胃腸階段差異較小，胃腸液 pH 不是主要的影響因素。崔玉靜等[17]采用體外模擬法研究了某種金屬污染區(qū)域土壤中Cd、Pb、Zn的生物可給性，發(fā)現(xiàn)胃階段Cd、Pb、Zn的生物可給性均高于小腸階段，且造成這一結果的原因可能與胃部的酸性環(huán)境有關。李繼寧等[18]采用SBET方法對湖南株洲市42個農田土壤樣品中Cr、Cu、Zn、As、Cd和 Pb 的生物可給性進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)，土壤中各重金屬生物可給性變化很大，生物可給性平均值為 Cd(66.0%)>Pb(59.0%)>Cu(44.9%)>Zn(35.8%)>As(16.9%)>Cr(5.72%)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，用重金屬總量及選擇的土壤理化性質通過回歸模型可較好地預測土壤重金屬的生物可給量。陳海珍等[19]采用體外試驗方法對廣州市不同功能區(qū)土壤鉛(Pb)的生物可給性進行研究，發(fā)現(xiàn)Pb在模擬胃消化階段的平均生物可給性(36.55%)，遠遠高于小腸消化階段(9.03%)，此結果與上述部分研究報道一致[15～17]。Navarro等[20]采用體外模擬法研究了西班牙某廢棄礦中Pb、Cd和As的生物可給性，發(fā)現(xiàn)Cd的生物可給性最大，且礦物組成和pH值是影響這三種重金屬生物可給性的重要因素。Laura等[21]采用體外模擬法研究了意大利某地表層土壤中Pb、Cu、Zn、Ni、Cr的生物可給性，結果發(fā)現(xiàn)Pb和Zn在胃液中的可給性大于在腸液中的可給性，這與陳海珍等[19]的研究結果一致，但是Cu和Ni則相反；研究中還發(fā)現(xiàn)若綜合考慮土壤的pH、有機質含量以及土壤類型等因素，可用土壤重金屬總量結果預測其生物可給性，這又與李繼寧等[18]的研究結果一致。

2.2食物中重金屬的生物可給性研究

2.2.1動物性食物中重金屬的生物可給性

動物性食物中重金屬的生物可給性目前主要集中于魚、蝦等水產(chǎn)品中的砷、汞上。對于砷，其生物可給性的研究主要集中于各種貝類和蝦類食物。Sloth等[22]發(fā)現(xiàn)挪威海灘的藍貽貝(Mytilusedulis)中總砷含量為3～13.8mg/kg，無機砷含量較高(9%～42%)。加拿大海豹港的軟殼蛤(Myaarenaria)總砷含量218～228mg/kg，其中生物可給部分占34%～46%，以無機砷((86±42)%)為主[23]。而Williams等[24]研究表明小龍蝦(Cheraxdestructor)總砷含量較低(4.4～15mg/kg)，生物可給性砷含量較高(占38%～78%)，也以無機砷(( 94±19)%)為主。這可能與水產(chǎn)品的種類和有機砷的種類有關。

汞的生物可給性研究主要集中于各種魚類食物。與砷不同的是，有機態(tài)汞對生物可給汞的貢獻較大。2005年西班牙市售旗魚(Xiphiasgladius)體內生物可給的汞(0.17～1.72mg/kg)占總汞的38%～83%；生物可給的甲基汞含量(0 .16～1.53mg/kg)占總生物可給量的94%[25]。

各類動物源性食物中多種金屬的生物可給性之問有差異，烹飪降低了這些金屬的生物可給性。魚蝦類中金屬元素的生物可給性較高，受元素的存在形式、亞細胞分布、元素間的相互作用以及烹飪處理的影響。He等[26]研究了扇貝、牡蠣、蚌、鮑魚等海洋動物中12種重金屬元素的亞細胞分布及其生物可給性，結果顯示，Pb主要分布在細胞碎片中，平均生物可給性為48%，清蒸后降為20%。Amiard等[27]從法國、英國和香港采集了7種海洋軟體類動物(包括蛤、軟體動物、牡蜘、扇貝和腹足類)進行體外模擬實驗，研究結果表明，蒸煮前Pb生物可給性的平均值為33%，在鹽水中煮熟后其生物可給性從最大值的52%降為20%。

2.2.2植物性食物中重金屬的生物可給性

植物源性食物中重金屬的生物可給性研究主要集中于海藻類食物中的砷。加拿大海豹港的海藻(Fucussp.)總砷含量為27～43mg/kg，其中生物可給量占63%～81%，以無機砷為主，海藻中含量較少的有機砷幾乎都是生物可給的[23]。有研究發(fā)現(xiàn)Hijikiafusiforme經(jīng)烹飪后總砷和無機砷含量降低了30%～50%，海藻中生物可給的As( III)含量(為7.1～25.4 mg/kg，占5%～17%)也降低，而生物可給的無機砷升高了11.8%～30.4%[28]。Intawongse等[29，30]分析了萵苣、菠菜、胡蘿卜和小蘿卜中的Cr、Cd、Cu、Fe、Mn、Ni、Pb和Zn，發(fā)現(xiàn)不同元素表現(xiàn)出的生物可給性存在差異。Cr和Pb的生物可給性較低，大部分污染物以殘留態(tài)存在(Cr,32%～81%；Pb,34%～70%)。相反，Mn、Cu、Zn和Mo的生物可給性較高，少量存于殘留態(tài)。同種元素在不同植物中表現(xiàn)出的生物可給性也有差異,Mn和Zn在萵苣中表現(xiàn)的生物可給性最高(分別為63.7%和45.2%),Cu和Cd的生物可給性在小胡蘿卜中最高(分別為62.5%和54.9%),在萵苣和菠菜中腸階段的生物可給性較高(分別為35%～55%和37%～60%)，胡蘿卜和小蘿卜略低，而生物可給的Fe在胡蘿卜和小蘿卜中較高(分別為25%～32%和26%～32%)，在萵苣和菠菜中略低。Hu等[31]調查了香港超市和菜場上的葉菜類、瓜果類、莖干類、塊根類、豆科類等9大類蔬菜中Cr、Cd、Cu、Fe、Ni、Pb、Zn等重金屬含量水平，發(fā)現(xiàn)莖干類蔬菜中Pb的生物可給性最高，為68%，塊根類最低，為20.2%。Koch等[32]還研究了42種印度藥物中Pb的生物可給性，發(fā)現(xiàn)76%的藥品中含有生物可利用的Pb，其生物可給性最大值為94%。

2.3In vitro方法的影響因素研究

2.3.1土壤中重金屬的生物可給性的影響因素研究

在土壤中重金屬的生物可給性方面，研究較多的影響因素主要包括pH、土液比、土壤重金屬存在形態(tài)、食糜等。由于不同的研究者采用的試驗條件不同，導致研究結果也有差異。

1)pH付瑾等[16]的研究認為土壤pH、腸階段的pH分別對鉛、鎘的生物可給性產(chǎn)生影響，但對砷的生物可給性影響不大；Yang等[33]的研究認為土壤pH升高能顯著降低Pb的生物可給性；而SIPS等[34]的研究卻認為土壤pH對Pb的生物可給性無顯著影響。

2)土液比付瑾等[16]的研究認為，在胃階段及腸階段，隨著土液比上升，鉛、鎘、砷3種重金屬的生物可給性均趨于降低(除了腸階段中紅壤鎘以外)，這與Yang等[33]的研究較一致，認為當土液比從1︰5000到1︰100，美國澤西市土壤鉛和砷的生物有效性降低。付瑾等[16]的研究發(fā)現(xiàn)不同土液比處理下，紅壤中鉛生物可給性大于棕鈣土，而砷則相反，紅壤和棕鈣土中鎘的生物可給性差異不明顯。這與Hamel等[35]的研究有一致性，認為土液比對鉛和砷生物可給性的影響主要取決于土壤性質。

3)重金屬形態(tài)主要包括可交換態(tài)、碳酸鹽結合態(tài)、易還原態(tài)(錳氧化物結合態(tài))、有機結合態(tài)、無形態(tài)鐵結合態(tài)、晶體鐵結合態(tài)以及殘渣態(tài)(硅鋁酸鹽結合態(tài))重金屬，并且重金屬的移動性和生物可給性依次降低[36]。楊杰等[37]對攀枝花地區(qū)農田土、礦物及尾礦樣品及Ni在胃階段、腸階段、仿生消化殘留態(tài)和形態(tài)分級各形態(tài)質量比之間的相關性進行分析，發(fā)現(xiàn)樣品中Ni主要以殘渣態(tài)形式存在且腸階段的攝取量和Ni在樣品中的結合緊密程度有關。

4)食糜崔巖山等[38]、Schroder等[39]及Ruby等[40]的研究顯示，模擬消化系統(tǒng)中添加食物(面團和兔食)會降低Pb的生物可給性；然而馬什納等發(fā)現(xiàn)當加入奶粉時，Pb的生物可給性增加較明顯[12]。

5)土壤粒徑Ljung等[41]的研究表明，當土壤粒徑為0～50μm時，模擬胃液中重金屬的生物可給性與胃液pH有顯著地相關性，當粒徑增大后，則相關性不顯著；崔巖山等[12]對土壤Cd生物可給性的研究表明，w(黏粒)較高的土壤其Cd溶解量較低，這與鄭順安等[42]的研究結果一致；但De Miguel等[6]研究發(fā)現(xiàn)，32種污染表層土壤中，Cu、Pb和Zn的生物可給性可以由w(有機質)、w(氧化鐵)預測，w(黏粒)并不是關鍵因素。

此外，有機質含量、微生物等也可能影響土壤中重金屬的生物可給性。

2.3.2食物中重金屬的生物可給性的影響因素研究

在食物中重金屬的生物可給性方面，研究較多的影響因素包括烹飪以及添加劑[33,43，44]。一般來說，烹飪會降低食物中重金屬的生物可給性，原因可能是烹飪后食物中的蛋白質、脂肪等結構發(fā)生變化，導致重金屬與這些成分的結合能力加強，從而降低了其在消化道中的溶解性。而添加劑對不同食物中重金屬生物可給性的影響則具有較大的不確定性。

2.4In vitro方法存在的問題

1)土壤及作物中重金屬的生物可給性的影響因素多且復雜，但目前的研究只是對少數(shù)影響因素進行了分析，缺乏生物可給性與各影響因素之間的整合研究。為此，今后在應用體外模擬方法時應充分考慮這兩者間的關系，進行系統(tǒng)的研究。

2)土壤中重金屬的生物可給性僅僅反映了土壤進入人體消化道后，重金屬在人體胃腸道中的溶解狀態(tài)，即重金屬可能被人體吸收的最大量。但并不是所有的溶解態(tài)的重金屬都能被人體所吸收，只有溶解態(tài)的重金屬被小腸上皮細胞或其他器官吸收后才能進入血液循環(huán)系統(tǒng)，從而危害人體健康。因此，運用invitro方法可能會高估重金屬的毒性。為準確獲取土壤重金屬被人體的吸收量，需采取進一步的模擬方法研究胃腸道消化液中能被吸收的重金屬的量值，即重金屬的生物有效性的量。

3展望

雖然目前對于重金屬的生物可給性研究已取得較大進展，但我國在基于土壤及作物中重金屬生物可給性的體外模擬研究領域仍需重點開展如下研究：

1)基于我國人群胃腸消化特征的土壤重金屬人體可給性標準測試方法研究。在國外現(xiàn)有方法的基礎上，結合我國人體胃腸消化特征(包括胃腸液組分、pH、胃腸階段提取時間、固液比等)以及典型重金屬和土壤的理化特征，對方法進行優(yōu)化，確保方法的測試環(huán)境能夠較好地模擬重金屬隨土壤經(jīng)口攝入后我國人群胃腸系統(tǒng)中的釋放，使測試結果更客觀，最終建立不同土質中不同重金屬人體可給性的標準測試方法。

2)進一步對影響土壤及作物中重金屬生物可給性的關鍵因素以及不同形態(tài)重金屬含量與可給性的相關性進行系統(tǒng)研究。楊杰等[37]通過體外仿生消化及Wenzel等的重金屬形態(tài)分級法雖可較好地表征樣品中重金屬的生物可給性和形態(tài)分布，但其研究結果只是對攀枝花地區(qū)農田土、礦物及尾礦樣品中Ni、Cr及Zn的形態(tài)分布和可給態(tài)的分析，該法是否適合其他樣品類型和其他金屬元素，還需做更多的分析研究。在此基礎上，建立基于關鍵影響因素及不同化學形態(tài)重金屬含量的生物可給性經(jīng)驗預測模型，對研究重金屬生物可給性具有十分重要的指導意義。

3)結合動物毒理試驗，對建立的重金屬生物可給性測試標準方法進行進一步驗證研究，確保測試結果的可信性。同時，進一步開展重金屬有效性的模擬測試方法研究，如Caco-2細胞模型：Caco-2細胞來源于人類結腸癌及直腸癌細胞，其形態(tài)、功能及滲透性等方面與人體的小腸上皮細胞相似，最初作為一種藥物立體口服特性篩選模型，現(xiàn)已被廣泛用來研究外源化學物，特別是各種環(huán)境污染物(包括金屬離子，有機污染物等)的吸收代謝情況。此方法可以消除動物模型和人體的巨大差異[29]。據(jù)有些研究，一般通過Caco-2細胞的吸收實驗對體外消化后得到的消化液作進一步的處理，來研究污染物(或營養(yǎng)物)的生物有效性。為此，可以通過測試模型研究來模擬重金屬在人體小腸中的跨膜吸收過程及其生物有效性，從而逐步建立基于重金屬生物有效性的健康風險評估方法。

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[收稿日期]2015-10-12

[基金項目]國家環(huán)保公益專項(201309003、201309037)；廣東省教育部產(chǎn)學研結合項目(2012B091000152)；廣東省科技計劃項目(2013B020700010)。

[作者簡介]黃玲(1991-)，女，碩士生，研究方向為土壤重金屬污染修復與評價。通信作者：周存宇,zhoucy@yangtzeu.edu.cn。

[中圖分類號]X17

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-1409(2016)03-0042-06

[引著格式]黃玲,周存宇,陳志良，等.土壤及作物中重金屬生物可給性的體外模擬研究進展[J].長江大學學報(自科版) ，2016，13(3)：42～47.