基于抗氧化活性的抗壞血酸-氨基酸衍生物制備工藝的優化

聞霞,李娜,滕右露,范娟林,周婷,喬艷紅，張強

安徽科技學院生命科學學院，安徽 蚌埠 233100

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基于抗氧化活性的抗壞血酸-氨基酸衍生物制備工藝的優化

聞霞,李娜,滕右露,范娟林,周婷,喬艷紅，張強

安徽科技學院生命科學學院，安徽 蚌埠 233100

[摘要]以抗氧化活性(還原力)為考察指標，先采用單因素試驗探討了氨基酸種類、體積比、pH和加熱時間4個因素對抗壞血酸-氨基酸衍生物制備反應的影響，再通過正交試驗確定了抗壞血酸-氨基酸衍生物的最佳制備工藝。結果表明，抗壞血酸-氨基酸衍生物的最佳制備工藝如下：抗壞血酸與精氨酸發生反應，二者的體積比為2∶1，pH為10.0，沸水浴90min，此條件下制備的衍生物還原力最強，大約是同濃度抗壞血酸的2.17倍，提示該方法是改善抗壞血酸抗氧化活性的有效方法。

[關鍵詞]抗壞血酸；精氨酸；抗氧化活性 ；制備工藝

氧化應激是指機體活性氧自由基簇(ROS)產生過多或/和機體抗氧化能力下降、ROS清除不足而導致的活性氧在體內增多并引起細胞氧化損傷的病理過程[1]。從人體的衰老到老年神經退行性疾病，從死亡率最高的心腦血管疾病到最可怕的癌癥，人類的許多疾病都與體內的氧化應激反應有關[2]。抗氧化劑(天然、人工合成)可預防機體因氧化應激所造成的生物大分子的系列損傷。由于人工合成的抗氧化劑如2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)等具有一定的毒性和致癌作用[3，4]，所以評價和篩選具有強抗氧化活性的天然抗氧化劑已成為生物學、醫學和食品科學研究的新趨勢。L-抗壞血酸(L-ascorbic acid)又名維生素C，廣泛存在于各種新鮮的蔬菜和水果中，是含有6個碳原子的酸性多羥基化合物，也是一種重要的以抗氧化功能為特色的水溶性維生素。抗壞血酸具有抗癌活性，能夠預防心血管疾病、提高人體的免疫力，還能夠通過清除人體正常代謝產生的自由基而起到延緩衰老的作用[5,6]。抗壞血酸作為抗氧化劑在食品、化妝品及醫藥等領域已得到廣泛應用。但是，由于抗壞血酸分子中有烯二醇基團，在熱、空氣和金屬離子的存在下，易于氧化變質，因而不穩定性成為其使用過程中的一大障礙[7,8]。對抗壞血酸進行結構改性，可以增強其穩定性，甚至可以提高其抗氧化活性，擴大應用范圍，已成為當前食品科學領域研究的熱點之一[9]。除了已成功開發的抗壞血酸鈣、抗壞血酸鈉、抗壞血酸硬脂酸酯等衍生物外，近年來殼聚糖抗壞血酸鹽[10]、抗壞血酸肉桂酸酯[11]和抗壞血酸沒食子酸酯[12]等一些新的抗壞血酸衍生物合成的研究相繼被報道，但有關抗壞血酸-氨基酸衍生物合成的研究報道鮮見。因此，本研究探討了抗壞血酸-氨基酸衍生物的制備工藝，以期為新型抗壞血酸衍生物的合成與應用提供參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

抗壞血酸、精氨酸、谷氨酸、酪氨酸、脯氨酸、賴氨酸、亮氨酸均為BR(滬試)，購自國藥集團化學試劑總公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸及三氯化鐵等試劑，除特別注明外均為國產分析純。

1.1.2主要儀器

精密pH計：PHS-3C型，上海雷磁儀器廠產品；數顯恒溫水浴鍋：HH-4型，國華電器有限公司產品；萬分之一電子天平：BT354S-XM型，北京賽爾斯精密儀器有限公司產品；紫外可見分光光度計：TU-1810型，北京普析通用儀器有限公司產品。

1.2試驗方法

1.2.1抗壞血酸-氨基酸衍生物制備的單因素試驗

1)氨基酸種類對制備反應的影響0.02mol/L的抗壞血酸分別與0.02mol/L的亮氨酸、脯氨酸、賴氨酸、谷氨酸、精氨酸、酪氨酸等體積混合于具塞試管中，然后用1mol/L的HCl和NaOH調節pH至9.0，反應體系總體積為10mL，將試管置于沸水中加熱30min，于冰浴冷卻，測定產物的還原力。

2)抗壞血酸與氨基酸的體積比對制備反應的影響分別按體積比4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3移取0.02mol/L的抗壞血酸和0.02mol/L精氨酸，用1mol/L的HCl和NaOH調節溶液的pH值至9.0，反應體系的總體積為10mL，將試管置于沸水中加熱30min，于冰浴冷卻，測定產物的還原力。

3)pH對制備反應的影響按體積比2∶1分別取0.02mol/L的抗壞血酸和0.02mol/L的精氨酸于試管中，然后用1mol/L的HCl和NaOH分別調節溶液的pH至6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，反應體系的總體積為10mL，將試管置于沸水中加熱30min，于冰浴冷卻，測定產物的還原力。

4)加熱時間對制備反應的影響按體積比2∶1分別取0.02mol/L的抗壞血酸和0.02mol/L的精氨酸于試管中，然后用1mol/L的HCl和NaOH調節溶液的pH至10.0，反應體系總體積為10mL。將各試管置于沸水中分別加熱30、60、90、120、150、180min，于冰浴冷卻，測定產物的還原力。

1.2.2抗壞血酸-氨基酸衍生物制備的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用L9(34)正交表進行正交試驗設計，各因素、水平的設計如表1所示。

表1　正交試驗設計的因素、水平表

1.2.3還原力的測定

參照Duan等[13]的方法并略作修改。于試管中加入樣品液0.5mL，用0.2mol/L pH6.6的磷酸鹽緩沖溶液補足至2.5mL，再加入5mL 1%鐵氰化鉀，混勻。各試管置于50℃水浴20min，然后加入10% 的三氯乙酸(TCA)2.5mL，搖勻，3500r/min離心10min。吸取上清液2.5mL，加入0.5mL 0.1%的三氯化鐵溶液和2.5mL蒸餾水，搖勻，靜置3～5min，于700nm處測定光密度，光密度值越大，還原力越強，抗氧化活性也越強。

1.2.4紫外光譜掃描

為判定反應的發生，分別對抗壞血酸、氨基酸和最佳反應條件下制備的抗壞血酸-氨基酸衍生物溶液于波長190～400nm范圍內進行紫外光譜掃描。

2結果與分析

2.1抗壞血酸-氨基酸衍生物制備的單因素試驗2.1.1氨基酸種類對制備反應的影響

不同的氨基酸所含有的基團不同，酸堿性不同，極性大小也不同，從而會影響制備反應的發生。從圖1可以看出，在6種氨基酸中，精氨酸與抗壞血酸反應產物的還原力最大，6種氨基酸與抗壞血酸反應后產物還原力的大小順序依次為：精氨酸>賴氨酸>亮氨酸>谷氨酸>脯氨酸>酪氨酸。

圖1　氨基酸種類對制備反應的影響

2.1.2抗壞血酸與氨基酸的體積比對制備反應的影響

抗壞血酸與氨基酸的體積比會影響二者間的碰撞，從而影響反應的發生。從圖2可知，隨著反應體系中氨基酸所占比例的增加，產物抗氧化活性呈先增后減的變化趨勢，當抗壞血酸與精氨酸的體積比為2∶1時，產物的抗氧化性最強。

圖2　體積比對制備反應的影響

2.1.3pH對制備反應的影響

pH會影響反應物分子上各種基團的解離，從而會對反應的發生產生影響。從圖3可以看出，隨著反應體系pH的增加，產物的抗氧化活性呈先增后減的變化，在pH為10.0時，產物的抗氧化性也最強。

圖3　pH對制備反應的影響

2.1.4加熱時間對制備反應的影響

加熱時間會影響反應的進程，從而會影響產物的抗氧化活性。從圖4可知，隨著加熱時間的延長，產物的抗氧化活性呈先增后減的變化，在加熱時間為60min時，產物的抗氧化性最強。

圖4　加熱時間對制備反應的影響

2.2抗壞血酸-氨基酸衍生物制備的正交實驗

抗壞血酸-氨基酸衍生物制備的正交試驗結果分別如表2和表3所示。從表2的極差分析和表3的方差分析可知，影響抗壞血酸-氨基酸衍生物制備的各因素的排列順序為：B>C>D>A，即體積比>pH>加熱時間>氨基酸種類；體積比和pH對制備反應的影響極顯著(P<0.01)，加熱時間對制備反應的影響顯著(P<0.05)；抗壞血酸-氨基酸衍生物的最佳制備工藝為A2B1C2D3，即抗壞血酸與精氨酸進行反應，二者的體積比2∶1、pH為10.0、加熱時間為90min，在此條件下制備的產物的還原力最強。

表2　正交試驗的極差分析表

注：*表示顯著水平在0.05，**表示顯著水平在0.01。

表3　正交試驗的方差分析表

2.3抗壞血酸反應前后抗氧化活性的比較

圖5　抗壞血酸-氨基酸衍生物與抗壞血酸還原力的比較

由圖5可知，抗壞血酸在與氨基酸發生反應前后抗氧化活性的差異很大，在最佳制備工藝條件下制備的抗壞血酸-精氨酸衍生物的還原力大約是反應前的2.17倍，表明抗壞血酸經過氨基酸的衍生反應以后抗氧化性得到明顯提高。

2.4產物鑒定

由圖6的紫外掃描圖譜可知，與精氨酸和抗壞血酸相比，抗壞血酸-精氨酸衍生物的紫外掃描圖譜有明顯的不同，精氨酸在205nm附近有最大吸收峰，抗壞血酸在230nm附近有最大吸收峰，而抗壞血酸-精氨酸衍生物在200nm和255nm附近分別有2個最大吸收峰，說明精氨酸與抗壞血酸反應后生成了全新的物質，即本研究所制備的抗壞血酸-精氨酸衍生物。

圖6　抗壞血酸、精氨酸及抗壞血酸-精氨酸衍生物的紫外掃描圖譜

3結論

抗壞血酸-氨基酸衍生物的最佳制備工藝為：抗壞血酸與精氨酸發生反應，二者的體積比為2∶1,pH為10.0，沸水浴90min，此條件下所獲得的衍生物的還原力最大；抗壞血酸-氨基酸衍生物的抗氧化性較原抗壞血酸有大幅度的提高，還原力大約是反應前的2.17倍，表明本方法是改善抗壞血酸抗氧化活性的有效方法。此外，抗壞血酸-精氨酸衍生物是在沸水浴條件下制備的，因此，熱穩定性較抗壞血酸已明顯增強，但空氣、金屬離子等其他方面因素對于抗壞血酸-精氨酸衍生物的影響還有待于進一步的研究。

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[收稿日期]2015-11-12

[基金項目]大學生創新創業訓練計劃項目(108792015048)；大學生創新科研基金項目(15XSZ36)。

[作者簡介]聞霞(1995-)，女，現從事食品生物技術研究。通信作者：張強，zq7964@163.com。

[中圖分類號]TS201.2+4

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-1409(2016)03-0048-06

[引著格式]聞霞,李娜,滕右露,等.基于抗氧化活性的抗壞血酸-氨基酸衍生物制備工藝的優化[J].長江大學學報(自科版) ，2016，13(3)：48～53.