益景湯對糖尿病大鼠心臟血流動力學指標和心肌細胞凋亡的影響*

趙　利　鄭　直　劉光輝　王　麗　陳　豐　翁錦龍　石　洪　林夢龍

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益景湯對糖尿病大鼠心臟血流動力學指標和心肌細胞凋亡的影響*

趙利鄭直劉光輝王麗陳豐翁錦龍石洪林夢龍

【摘要】目的：觀察益景湯對糖尿病(DM)大鼠心臟血流動力學、心肌肥大和心肌細胞凋亡的影響。方法：采用鏈脲佐菌素(STZ)成功誘導DM大鼠模型，將成模大鼠分為益景湯治療組(每天湯藥灌胃3ml，相當于生藥10.71g/kg)、貝那普利治療組(每天腹腔注射10μg/kg)、模型組(每天給予3ml生理鹽水灌胃)，每組20只，另選20只為正常組(每天灌胃3ml生理鹽水)。連續12周后采用動脈插管測定心臟血流動力學指標左室壓力(LVP)、左室內壓最大上升/下降速率(+dp/dtmax和-dp/dtmax)及左室舒張末壓(LVEDP)。之后稱取大鼠體重(BW)，并取各組大鼠心臟稱重(HW)，再取左室稱重(LVH)，計算心臟質量指數(HMI)和左室質量指數(LVMI)；切取部分左室制備心肌組織切片，采用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡。結果：方差分析顯示，各組大鼠心臟血流動力學指標及HMI和LVMI均有統計學差異(P均<0.01)。兩兩比較表明，DM各組LVP、+dp/dtmax及-dp/dtmax均低于正常組，且模型組<益景湯治療組<貝那普利治療組，差異均有統計學意義(P均<0.01)；DM各組LVEDP 均高于正常組，且模型組>益景湯治療組>貝那普利治療組，差異也有統計學意義(P均<0.01)；DM各組HMI和LVMI均明顯高于正常組(P<0.01)，但益景湯治療組與模型組之間無統計學差異(P>0.05)；DM大鼠治療組較模型組心肌細胞的凋亡程度輕，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論：DM大鼠在第12周已經出現心肌凋亡，益景湯能改善DM大鼠心臟血流動力學，抑制心肌細胞凋亡。

【關鍵詞】益景湯；糖尿病心肌病；血流動力學；心肌細胞；凋亡；大鼠

糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者發生心力衰竭比例顯著高于非糖尿病患者的原因之一。國外研究顯示DCM的發生率為0．76%[1]。心臟肥大和功能障礙是DCM的重要臨床表現，心肌細胞凋亡在DCM發生、發展過程中起一定作用[2]。我們的前期研究證實加味補陽還五湯，即本次研究所用益景湯對DCM相關病理指標有改善作用[3]，本文觀察益景湯對DM大鼠心臟血流動力學指標和心肌細胞凋亡的影響。

1材料和方法

1.1實驗動物

6周齡健康雄性清潔級SD大鼠86只，體重(250±20)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK(滬)2007-0005。

1.2主要藥物、試劑與儀器

益景湯(生黃芪15g、山藥15g、蒼術9g、桃仁5g、紅花5g、當歸9g、川芎6g、赤芍10g、茯苓15g、生地15g、玄參15g，放入200ml自來水中文火煎至湯汁約50ml時紗布過濾備用。由本院藥劑科完成)。貝那普利注射液(洛汀新，瑞士諾華公司)；鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司，貨號S0087 )；TUNEL試劑盒(美國Sigma公司，貨號G6980 )；血糖(BG)測定試劑盒(北京拜爾迪生物技術有限公司，貨號EBGL-200)。壓力換能器(YP100，河南鄭州)，BL-420生物信號采集與處理系統(河南鄭州)，生物光學顯微鏡(奧林巴斯CX22型)，血糖儀(One Touch UltraVue,美國Johnson公司)。

1.3實驗方法

1.3.1DM模型制備及分組：86只SD大鼠，20只作為正常組，余66只復制DM模型：適應性喂養1周，禁食12h后，一次性腹腔注射STZ(60mg/kg)誘發DM。STZ臨用前以0.1mmol/L、pH4.5檸檬酸緩沖液溶解，配制成1%溶液。于腹腔注射前及注射后72h取尾血檢測每只大鼠BG，其值≥16.7mmol/L者即為DM大鼠[4]。本次造模過程中6只大鼠意外死亡。60只成模大鼠隨機分為模型組、益景湯組、貝那普利治療組，每組各20只。

1.3.2各組大鼠給藥、處理：從大鼠成模當天開始給藥或處理，持續12周。益景湯治療組采用益景湯灌胃，按臨床方劑每日劑量10.71g/kg計算，取益景湯1.35ml，加蒸餾水稀釋至3ml，一次性灌胃，每日1次。貝那普利治療組大鼠腹腔內注射貝那普利10mg/kg，每日1次；正常組、模型組給予等量生理鹽水3ml灌胃，每日1次；各組用藥或其它處理12周，期間均行常規飼養，并每周測1次BG和觀察記錄一般狀況。

1.3.3血流動力學指標測定：干預12周后，各組大鼠以20%烏拉西坦(0.5ml/kg)靜脈泵入麻醉后，頸動脈插管連接壓力換能器，經左頸總動脈插管至左心室腔內，通過壓力換能器描記左心室壓力(Left Ventricular Pressure，LVP)曲線，通過BL-420生物信號獲取與處理系統采集LVP電信號，分別測定左心室內壓最大上升速率(Maximum Rate of Rise of LVP，+dp/dtmax)和最大下降速率(Maximum Rate of Decrease of LVP，-dp/dtmax)以及左心室舒張末壓(Left Ventricular end Diastolic Pressure,LVEDP)。連續測量10個心動周期，取均值。

1.3.4心肌肥厚和心肌細胞凋亡檢測：測定心臟血流動力學指標后斷頸處死各組大鼠，迅速稱取體重(BW)后取出心臟，用冷等滲鹽水洗凈,濾紙吸干,稱取并記錄心臟重量 (HW，g)及左心室重量(LVH，mg)，計算心臟質量指數(HMI=HW/BW)及左心室質量指數(LVMI=LVH/BW)。然后將心臟標本編號后采用多聚甲醛固定、常規方法脫水、透明、浸蠟、包埋、連續切片(4μm)、展片與粘片后烘干。每只大鼠取10張切片，采用過氧化物酶標法按照TUNEL原位凋亡試劑盒說明書染色步驟操作。高倍鏡(×400)下計數目鏡方格內10個視野TUNEL陽性細胞數(呈棕褐色)，取均值進行統計學分析。

1.4統計學處理

2結果

2.1各組大鼠血流動力學指標

方差分析顯示，各組大鼠LVP、+dp/dtmax、-dp/dtmax和LVEDP差異均有統計學意義(P<0.01)。兩兩比較結果表明，模型組大鼠LVP、+dp/dtmax及-dp/dtmax較正常組明顯下降(t=18.273、13.328、19.009，P均<0.01)，LVEDP明顯升高(t=-19.90，P<0.01)；貝那普利組大鼠LVP、+dp/dtmax及-dp/dtmax較正常組大鼠明顯下降(t=3.229、6.540、9.466，P均<0.01)，LVEDP明顯上升(t=-9.748，P<0.01)，但較模型組LVP、+dp/dtmax及-dp/dtmax明顯升高(t=-13.70、-9.446、-13.10，P均<0.01)，LVEDP明顯下降(t=10.445，P<0.01)；益景湯治療組大鼠LVP、+dp/dtmax及-dp/dtmax也低于正常組(t=7.548、10.341、11.265，P均<0.01)，LVEDP也高于正常組(t=-13.20，P<0.01)；但較模型組LVP、+dp/dtmax及-dp/dtmax明顯上升(t=13.903、6.361、11.070，P均<0.01)，LVEDP明顯下降(t=-8.261，P<0.01)。貝那普利治療組LVP、+dp/dtmax及-dp/dtmax高于益景湯治療組(t=-3.110、4.684、-2.582，P<0.01)， LVEDP低于益景湯治療組(t=2.886，P<0.01)。見表1。

表1　各組大鼠血流動力學指標比較±s，n均=20)

注：與正常組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.01；與益景湯治療組比較，3)P<0.01

2.2各組大鼠HMI和LVMI

方差分析顯示，各組大鼠HMI和LVMI差異存在統計學意義(P<0.01)。兩兩比較結果表明，模型組大鼠HMI和LVMI明顯高于正常組(t=-26.61和-25.31,P<0.01)；益景湯治療組HMI和LVMI雖明顯高于正常組(t=-22.01和-21.31，P<0.01)，但與模型組差異無統計學意義(t=-1.629和-1.75，P>0.05)；貝那普利治療組大鼠HMI和LVMI亦明顯高于正常組(t=-9.115和-9.115，P<0.01)，但明顯低于模型組差異有統計學意義(t=14.791和13.723，P<0.01)；貝那普利治療組HMI和LVMI明顯低于益景湯治療組(t=12.062和11.161，P<0.01)。見表2。

2.3各組大鼠心肌細胞凋亡數

方差分析顯示，各組大鼠心肌細胞凋亡數差異存在統計學意義(P<0.01)。與正常組比較，模型組、益景湯治療組、貝那普利治療組凋亡細胞數均明顯增多(t=-32.90、-54.40、27.80，P<0.01)。與模型組比較，益景湯治療組和貝那普利組凋亡細胞數均明顯減少(t=-7.813、14.991，P<0.01)。與益景湯治療組比較，貝那普利組凋亡細胞更少(t=12.395，P<0.01)。見表3。

表2　各組大鼠HMI和LVMI比較均=20)

注：與正常組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.01；與益景湯治療組比較，3)P<0.01

表3　各組大鼠心肌細胞凋亡數比較±s，n均=20)

注：與正常組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.01；與益景湯治療組比較，3)P<0.01

3討論

WHO[5]估計,到2025年全世界DM患者可能達到3億，糖尿病心血管并發癥如DCM等引起的死亡占DM總死亡的70%以上，是非DM人群心血管系統疾病發病率和死亡率的2-3倍；DM患者發生心力衰竭的比例也顯著高于非DM患者(DCM)是DM嚴重并發癥之一。

DCM在臨床上主要以左心室肥厚和舒張功能不全為主要表現，收縮功能障礙隨病情進展逐漸加重；病理特征包括心肌細胞肥大、增生及凋亡。心肌細胞凋亡在DCM的發生、發展過程中起一定作用[2]。高糖培養早期大鼠心肌細胞即可凋亡[6，7]。隨著不斷增加的心肌細胞壞死和凋亡，心室重構進一步加重，逐漸出現心功能失代償和心臟舒縮功能進一步減退，最終出現心力衰竭[8，9]。即心肌細胞凋亡可能是導致DM心臟功能障礙的重要原因之一[10]。中醫治療DCM注重益氣、養陰、化瘀。益景湯為本院使用多年的經驗方[13]，由名方“補陽還五湯”化裁而來，方由黃芪、當歸、赤芍、川芎、桃仁、紅花、生地、玄參等組成，具有補氣通絡之效。我們的前期臨床研究表明，益景湯對DCM有治療作用[3]。另有研究報道，補陽還五湯可減少缺氧過程中一氧化氮、氧自由基的生成及抑制體外培養大鼠神經元細胞凋亡[11]，對抗缺氧后的炎性反應，抑制缺血后神經元凋亡[12]。

本研究結果顯示，(1)與正常組比較，模型組大鼠HMI和LVMI明顯增高(P<0.01)，提示DM大鼠存在心肌肥厚，益景湯治療大鼠HMI和LVMI有所降低，但與模型組差異無統計學意義(P>0.05)，且不及貝那普利對DM大鼠HMI和LVMI的作用(其與模型組差異有統計學意義，P<0.01)。原因可能與藥物干預時間不足以及實驗樣本量不夠有關。(2)與正常大鼠比較，DM模型大鼠LVP、-dp/dtmax和+dp/dtmax明顯降低，LVEDP明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，益景湯和貝那普利治療均可使LVP、-dp/dtmax和+dp/dtmax明顯升高，LVEDP明顯降低(P<0.01)。提示益景湯對DCM大鼠心功能有改善作用。(3)DM模型大鼠心肌細胞凋亡較正常大鼠明顯增加(P<0.01)，益景湯及貝那普利治療均可減少DM大鼠心肌細胞凋亡(P<0.01)，降低心功能損害。但益景湯通過何種具體信號通路干預DM大鼠心肌細胞凋亡有待進一步研究。

綜上所述，STZ實驗性DM大鼠成模12周即可出現心臟血流動力學改變、心肌肥厚和心肌細胞凋亡，益景湯雖然不能明顯減輕DM大鼠心肌肥大，但能夠顯著改善DM大鼠心功能，抑制心肌細胞凋亡，對治療DCM的發展和預防心衰有所禆益。

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趙利(1979-)，男、漢族、醫學碩士、主治醫師，主要從事中西醫結合心血管病研究

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Effects of Yijing Pill on Cardiac Haemodynamics and Myocardial Apoptosis in Diabetic Rats

ZHAO Li, ZHENG Zhi, LIU Guang-hui, WANG li, CHEN Feng, WENG Jin-long, SHI Hong，LIN Meng-long

The Affiliated People's Hospital of Fujian Traditional Chinese Medicine University，Fuzhou 350004，China

【Abstract】Objective: To explore effects of Yijing pill on cardiac haemodynamics and myocardial apoptosis in diabetic (DM) rat. Method: The model of DM rat was indeced by U-sing streptozotocin and then the DM rats were divided into the Yijing pill treatment group (Daily intragastric administration of 3ml decoction, equivalent to 10.71g/kg crude drug, n=20) , Benner Pury treatment group (Daily intraperitoneal injection of 10ug/kg, n=20) and the model group (Daily intragastric administration of 3ml normal saline, n=20). In addition, another 20 rats were selected as control group, and 3ml normal saline was poured into the stomach every day. The Left Ventricular Pressure (LVP), maximum left ventricular pressure rising and dropping rates (±dp/dt) and Left Ventricular End Diastolic Pressure (LVEDP) was measured by arterial catheterization after feeding for 12 weeks. After weighing the weight of rats, the heart and left ventricle of each group rats was taken out and weighed, and then the Heart Mass Index (HMI) and Left Ventricular Mass Index (LVMI) were calculated. Part of the left ventricle was used to make the myocardial tissue sections and TUNEL method was used to detect the apoptosis of myocardial cells.Results: Analysis of variance showed that there were significant differences in cardiac hemodynamic parameters, HMI and LVMI in all groups (P<0.01). Compared with the normal group, the LVP, +dp/dtmac and -dp/dtmax significantly decreased in all DM groups, and Model group < Yi Jing Tang treatment group < Benner Pury treatment group (all P<0.01). Compared with the normal group, the LVEDP significantly increased in all DM groups, and Model group > YiJing tang treatment group > benner pury treatment group (all P<0.01). Compared with the normal group, the HMI and LVMI was significantly increased in all DM groups (P<0.01), but there was no significant difference between the YiJing tang treatment group and the model group (P>0.05). The apoptosis of myocardial cells in DM rats appeared in twelfth weeks, which in treatment group was lighter than the model group (P<0.05).Conclusion: The myocardial apoptosis has emerged in DM rats in the first 12 weeks, and Yijing pill can inhibit myocardial apoptosis in DM rats.

【Key words】Yijing pill; Diabetic cardiomyopathy; Haemodynamics; Myocardial cell; Apoptosis; Rat

作者簡介：本文第一

[中圖分類號]R587.1R542.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1005-1740(2016)01-0006-05

*[基金項目]國家自然科學青年基金(81102619);福建省自然科學基金(2011j01197);福建省衛生廳青年基金(2011-2-33)

[作者單位]福建中醫藥大學附屬人民醫院，福州 350004

本文2015-07-16收到，2015-09-09修回