基于2D-DIGE技術對早期糖尿病腎病腎陰虛證型患者血漿蛋白質組學研究*

盧洪梅，鄒立華，湯水福，胡坤華

(1.廣東醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院中醫(yī)學教研室，廣東東莞 523808;2.深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳 518172;3.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，廣州 510405; 4.中山大學蛋白質組學轉化醫(yī)學廣東普通高校重點實驗室，廣州 510000)

基于2D-DIGE技術對早期糖尿病腎病腎陰虛證型
患者血漿蛋白質組學研究*

盧洪梅1，鄒立華2△，湯水福3，胡坤華4

(1.廣東醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院中醫(yī)學教研室，廣東東莞 523808;2.深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳 518172;3.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，廣州 510405; 4.中山大學蛋白質組學轉化醫(yī)學廣東普通高校重點實驗室，廣州 510000)

目的:尋找糖尿病腎病腎陰虛證敏感的血漿分子標志物。方法:對12例早期糖尿病腎病腎陰虛患者的血漿和12例正常血漿進行熒光差異雙向電泳(2D-DIGE)分析，選擇表達差異大于1.5倍的蛋白斑點進行質譜分析。結果:成功建立糖尿病腎病腎陰虛證和正常血漿的膠內(nèi)差異雙向凝膠電泳圖譜，通過分析共鑒定出11種差異蛋白質，包括結合珠蛋白、凝溶膠蛋白、載脂蛋白AI等。結論:熒光差異雙向電泳能夠客觀顯示糖尿病腎病腎陰虛證與正常血漿之間的蛋白質表達差異，本研究鑒定的11種蛋白有可能為糖尿病腎病的早期診斷和中醫(yī)證型研究提供潛在的血漿分子標志物。

糖尿病腎病;腎陰虛證;蛋白質組學;熒光差異雙向電泳

糖尿病腎病(DN)是指糖尿病進展到合并腎小球硬化階段，臨床以蛋白尿為突出表現(xiàn)。在我國，腎病已成為繼心血管、眼科病變之后高發(fā)病率的糖尿病并發(fā)癥［1］。許多研究者利用現(xiàn)代生物學技術，開展了DN中醫(yī)證型與實驗室指標、分子生物學以及遺傳學等相關性研究，如證候學研究［2］、證素演變規(guī)律［3］、證候診斷模型［4］、證候與實驗室指標相關性研究［5］。“證”是對疾病某一階段病因、病性、病位以及病機本質的概括，具有相對穩(wěn)定性;人體的蛋白質變化一定程度上可以推斷某時段某部位病理生理變化，同樣具有相對穩(wěn)定性。因此，越來越多的證型研究引入了蛋白質組學技術，如慢性乙肝、子宮內(nèi)膜異位癥、原發(fā)性肝癌、肺癌證型研究［6-9］、中醫(yī)證本質［10］等。其目的是試圖尋找和證實中醫(yī)證型的微觀物質基礎。本研究使用熒光差異雙向電泳和質譜分析的方法，初步篩查出DN腎陰虛證和正常人血漿中的差異蛋白質。

1 材料與方法

1.1 納入標準

研究對象均選自2013年1月至2013年8月廣州中醫(yī)藥大學一附院門診和住院病例，有明確早期糖尿病病史，年齡在18～45歲之間共12例;對照組選自體檢中心，體檢健康、年齡在18～45歲之間共12例。病例符合:①糖尿病腎病Mogensen分期標準中的III期，即早期糖尿病腎病期。腎小球濾過率(GFR)大致正常;UAE持續(xù)20～200μg/min(或30～300 mg/24 h)。病理:基底膜(GBM)增厚和系膜基質增加更明顯，已有腎小球結帶型和彌漫型病變以及小動脈玻璃樣變，并已開始出現(xiàn)腎小球荒廢。②依據(jù)中華中醫(yī)藥學會《糖尿病中醫(yī)防治指南》(2007年版)和《中藥新藥臨床研究指導原則》(2002年版)糖尿病腎陰虛證候診斷標準。主癥腰膝酸軟、五心煩熱，次癥眩暈耳鳴或耳聾、口燥咽干、潮熱盜汗，或骨蒸發(fā)熱、形體消瘦、失眠健忘、齒松發(fā)脫、遺精、早泄、經(jīng)少、經(jīng)閉、舌質紅少津，少苔或無苔、脈細數(shù)，具備主癥和至少2項次癥即可確診。

1.2 蛋白質組學研究方法

1.2.1 實驗器材 儀器設備:DeCyder V6.0分析軟件(Amersham Biosciences)、DU730型核酸/蛋白分析儀(Beckman)、UltraflexIII質譜儀(Bruker Daltonics)、IPGphor III等電聚焦儀、Ettan DALT six大型垂直電泳系統(tǒng)、Typhoon9400多功能激光掃描成像系統(tǒng)。試劑盒:除高豐度蛋白試劑盒(Sigma)、蛋白質純化試劑盒、2-D Quant Kit蛋白質定量試劑盒、IPG strip4-7，24 cm和IPG buffer(pH4-7)固相pH值干膠條、CyDye DIGE Flour(minimal Dye) Labelling Kit熒光標記試劑盒(GE healthcare)。

1.2.2 樣本制備 靜脈采血5 ml，置于肝素抗凝管，離心20 min(2000 r/min)，取離心后上清液存放于－80℃冰箱。標本收齊后分別取血漿80 μL，使用除高豐度蛋白試劑盒除去多數(shù)高豐度白蛋白及IgG，然后使用Clean-up Kit蛋白質純化試劑盒純化血漿蛋白，完成后給予2-D Quant Kit定量試劑盒進行血漿蛋白定量測定。

1.2.3 熒光雙向電泳 ①熒光標記。CyDye DIGE Flour(minimal Dye)Labelling Kit熒光標記試劑盒含有cy2、cy3和cy5共3種熒光，其中cy2用于標記內(nèi)參，內(nèi)參是指所有樣本等量混合后均分至各張膠的樣本量。每50 μg血漿蛋白用 Dye染料400pmol進行標記，之后使用賴氨酸終止反應，將cy2、cy3、cy5標記樣本依據(jù)實驗方案置于同一管內(nèi)。②第一向電泳。將已經(jīng)標記的血漿蛋白樣品均勻加至IPGphor III等電聚焦儀膠條槽，然后放入 IPG strip4-7，24 cm固相pH值干膠條，設置等點聚焦(IEF)參數(shù):30 V、6 h、step;60 V、6 h、Gradient;200 V、1 h、Gradient;500 V、2 h、Gradient;1000 V、2 h、Gradient;3500 V、2.5 h、Gradient;10000 V、2.5 h、Gradient;10000 V、8 h、step至總電壓伏小時數(shù)達80000 Vhr。IEF結束后，用含有10 mg/mL二硫蘇糖醇和25 mg/mL碘乙酰胺平衡緩沖液將IPG膠條分別平衡15 min。③第二向電泳。使用12.5% 的SDS-PAGE膠，先設置電泳參數(shù)2 W/膠，50 min后從膠條中提取蛋白，再用17W/膠的恒功率，當凝膠底部邊緣顯示溴酚藍指示劑即為完成。

1.2.4 膠內(nèi)差異圖像采集 膠內(nèi)差異圖像采集由Typhoon9400多功能激光掃描成像系統(tǒng)完成。選擇激光波長 cy2488nm、cy3532nm和 cy5633nm。然后用DeCyder V6.0分析軟件對圖像進行差異分析，凝膠圖像經(jīng)探點、分組、匹配分析后，計算Average ratio尋找差異蛋白，統(tǒng)計分析使用Student T-test法。選擇表達差異＞1.5倍且T-test P＜0.05的血漿蛋白斑點為差異蛋白質。

1.2.5 質譜分析 首先切取蛋白質斑點(把染色凝膠放進Spot handling workstation)，然后用胰酶(12.5 mg/mL)將切取的蛋白質酶解成肽段，再通過UltraflexIII質譜儀獲取肽質量指紋圖譜(PMF)及4個肽段的MS/MS圖譜。最后進行蛋白質斑點圖譜鑒定，以MASCOT(Matrix Science)為搜索引擎，使用Biotools檢索軟件。搜索參數(shù):NCBInr數(shù)據(jù)庫、human檢索種屬、combined數(shù)據(jù)檢索方式、允許最大漏切位點為1、胰蛋白酶。最終得分＞66分(質量誤差PMF 75ppm、MS/MS 0.5Da)為差異蛋白質。

2 結果

2.1 膠內(nèi)差異圖像

通過使用熒光差異雙向電泳技術，本研究準確獲得了早期糖尿病腎病腎陰虛證血漿蛋白表達圖譜。該圖譜由紅綠藍3個圖譜融合而成，綠色圖譜為糖尿病腎病血漿蛋白，紅色圖譜為正常血漿蛋白，藍色圖譜為內(nèi)參。

2.2 圖像分析

圖1 斑點1102在糖尿病腎病腎陰虛證和正常血漿中的表達

圖1 顯示，通過DeCyder 6.0軟件檢測，每塊熒光差異雙向凝膠電泳膠圖上約有1600個蛋白質斑點。最終鑒定出病例組和對照組中血漿蛋白質差異斑點(＞1.5倍且P＜0.05)有11個，病例組中6個斑點表達上升，5個斑點表達下調。斑點圖中斑點的位置和3-D圖對差異斑點的差異情況有清晰的展示，如斑點1102。

表1 差異斑點質譜鑒定結果

2.3 質譜結果

表1顯示，使用MALDI-TOF/TOF-MS分析，獲得11個差異蛋白質斑點的肽質量指紋圖。通過檢索NCBInr數(shù)據(jù)庫(human)獲取各差異蛋白質斑點名稱。

3 討論

DN屬于中醫(yī)“消渴病”范疇，其基本病機為陰虛燥熱，病位主要在肺、脾(胃)、腎，其中以腎尤為關鍵。DN是糖尿病發(fā)展到腎臟并發(fā)癥階段，即消渴日久、臟腑虛弱、正氣不足，故而出現(xiàn)多種變證;根據(jù)陰陽互根互用，消渴病久可致陰陽虛損，包括腎陽虛證和腎陰虛證。腎陰虛癥見腰膝酸軟、五心煩熱、眩暈耳鳴、口苦咽干、潮熱盜汗、多夢、舌紅少苔、脈細。五臟中腎主藏精。《素問·金匱真言論》:“夫精者生之本也。”腎陰虛證的物質基礎是腎精虛損。腎陰虛證是疾病過程中特定階段病因病機，即使在不同的疾病，也一定有相同的物質基礎。而“證”代表的是身體機能的即刻狀態(tài)，一定會受到疾病的影響，DN與其他疾病之間存在差異，因此其腎陰虛證之間也有差異。

應用蛋白質組學進行證型研究包括對陰虛證型的相關研究，如甲亢、慢性心衰、腦梗塞、癡呆、紅斑狼瘡陰虛證［11-16］。本研究對8例早期DN腎陰虛證和8例正常血漿進行蛋白組學研究，共發(fā)現(xiàn)差異表達蛋白11個，分別是尿苷酸合成酶亞型J、巨球蛋白、人血清白蛋白、補體C3、人免疫球蛋白、載脂蛋白AI、HP蛋白質、CD5抗原、原肌球蛋白-3、凝溶膠同工酶GT-B、人絨毛膜促性腺激素。

2D-DIGE技術靈敏度高，誤差低，重復性強。比較傳統(tǒng)的雙向凝膠電泳技術(考染、銀染)，優(yōu)勢在于引進內(nèi)參cy2校正組間差異;提高對低豐度蛋白的檢測靈敏度;改進1樣本/每膠為3樣本/每膠，去除膠間人為差異［17］。相較于高通量的蛋白質組學研究技術，如Luminex xMAP技術(液態(tài)芯片)，雖然該技術同樣采用熒光染色、內(nèi)參等技術方法，且具有高通量特性(1次檢測100個指標)，但2D-DIGE技術可以從源頭尋找蛋白質，原始創(chuàng)新;而高通量的芯片技術一般是基于已知蛋白［18］。

HP蛋白質是一種肝臟合成的糖蛋白［19］，其表達異常是血管內(nèi)膜損傷［20］和微循環(huán)障礙的危險因素。而消渴病陰液虧虛，虛火燔灼濃縮津液，血中津液不足，導致瘀血阻滯脈絡。故DN腎陰虛證與HP蛋白質高表達導致微循環(huán)障礙具有關聯(lián)性。

凝溶膠蛋白(gelsolin，GSN)是一種調節(jié)細胞結構和代謝的蛋白質［21］，在腎臟疾病中具有重要的作用。凝溶膠蛋白高表達促使細胞凋亡［22］，表現(xiàn)為高代謝狀態(tài)，與腎陰虛五心煩熱、口苦咽干、潮熱盜汗、舌紅等癥狀相符。故DN腎陰虛證與凝溶膠蛋白高表達促進細胞凋亡具有關聯(lián)性。

載脂蛋白AI是高密度脂蛋白(HDL)的主要成分［23］，能降低膽固醇［24］和低密度脂蛋白［25］。血脂紊亂是DM患者腎臟微循環(huán)障礙的重要危險因素。Overgaard等［26］證實，載脂蛋白A1在DN患者中呈低表達，并推斷其為DN早期診斷標記物，與本實驗結果相符。中醫(yī)認為載脂蛋白A1屬于精微物質，當其在體內(nèi)減少，是陰精逐漸虧虛，最終導致腎陰虧虛。因此，我們推測載脂蛋白A1可能是DN腎陰虛證型生物學標志物。

C3補體、人免疫球蛋白是與免疫相關蛋白質，其過度表達會導致糖尿病患者腎組織自損［27］。中醫(yī)認為，人免疫力的強弱與先天稟賦相關，而腎中陰精源于先天。先天稟賦不足，累及腎陰，機體呈腎陰虛體質，加之后天失養(yǎng)則致腎陰虛證。故DN腎陰虛證與補體C3b受體、人免疫球蛋白高表達導致免疫缺陷具有關聯(lián)性。

人絨毛膜促性腺激素(HCG)通過結合甲狀腺細胞TSH受體，能夠刺激甲狀腺活性。因此我們推斷，腎陰虛證諸如口干舌燥、心煩失眠、體質量下降等癥狀與甲狀腺作用失調相關。孫曉敏［28］證實，在不同腎病腎陰虛證中HCG均呈高表達狀態(tài)，與本實驗結果一致。

本實驗通過分子水平的研究，獲取了DN診斷和標記物信息，促進DN腎陰虛證的本質研究，有助于總結出腎陰虛證的一般規(guī)律。

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Research on Plasma Proteomics of Kidney Yin Deficiency of Early Diabetic Nephropathy Patients Plasma Proteomic Analysis Based on 2D-DIGE Technology

LU Hong-mei1，ZOU Li-hua2△，TANG Shui-fu3，HU Kun-hua4
(1.Department of TCM，the Second Clinical Medical School，Guangdong Medical College，Guangdong Dongguan 523808，China;2.Longgang People’s Hospital of Shenzhen，Guangdong Shenzhen 518172，China;3.Internal Medicine Dept.of Nephrology，the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China; 4.Key Laboratory of Proteomics Translational Medicine of Guangdong Higher Education Institutes，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510000，China)

Objective:To investigate the sensitive blood plasma molecular markers in kidney yin deficiency of diabetic nephropathy(DN).Methods:Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis(2D-DIGE)was used to analyse the plasma which was from the patients with kidney yin deficiency of early diabetic nephropathy and the normal person from 24 patients.Proteins that showed differential expression of a 1.5-fold change were analyzed by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry.Results:Two-dimensional electrophoresis(2-DE)maps of plasma proteins in patients with kidney yin deficiency of diabetic nephropathy(DN)and healthy adults were established successfully.We validated 11 differentially expressed proteins detected by 2D，including HP protein、gelsolin、apolipoprotein A-I，etc.Conclusion:Proteomic analysis can objectively reveal the differences of protein expression between the two kinds of blood plasma.The 11 proteins that we have found have potential to provide plasma molecular markers for the clinical diagnosis and research on TCM pattern of diabetic nephropathy.

Diabetic nephropathy;Kidney yin deficiency;Proteomics;2D-DIGE

R587.1

B

1006-3250(2016)06-0812-04

2015-12-08

廣東醫(yī)學院科研基金博士學位人員科研啟動項目(B2013008)-早期糖尿病腎病腎陽虛證型的血漿蛋白質組學分析

盧洪梅(1983-)，女，重慶人，醫(yī)師，醫(yī)學博士，從事中醫(yī)腎病的臨床與研究。

△通訊作者:鄒立華，Tel:13510089946，E-mail:zjgzzlh@126.com。