加味天雄散對弱精子癥患者精子P38MAPK/ERK信號通路的影響*

耿 強，郭 軍，王 福，韓 強，高慶和，趙 玉，李 重，余國今，歐陽斌

(1.天津中醫藥大學第一附屬醫院男科，天津 300193;2.中國中醫科學院西苑醫院男科，北京 100091; 3.首都醫科大學附屬北京中醫醫院男科，北京 100010)

加味天雄散對弱精子癥患者精子P38MAPK/ERK信號通路的影響*

耿 強1，郭 軍2，王 福2，韓 強3，高慶和2，趙 玉1，李 重1，余國今2，歐陽斌1

(1.天津中醫藥大學第一附屬醫院男科，天津 300193;2.中國中醫科學院西苑醫院男科，北京 100091; 3.首都醫科大學附屬北京中醫醫院男科，北京 100010)

研究加味天雄散對弱精子癥患者精液p38MAPK/ERK信號傳導通路的影響。方法:臨床選取弱精子癥患者分為正常組、弱精組、補腎組、健脾組、全方組，分別對補腎、健脾、全方組給予3個月的治療，治療后觀察3組患者的精液常規指標，并測定5組ERK、P38磷酸化和蛋白表達水平。結果:各組與治療前比較，A級精子和A+B級精子百分率均上升，差異有統計學意義;與對照組、補腎組、健脾組治療后比較，全方組A級精子和A+B級精子百分率改善更明顯，差異有統計學意義;與正常組比較，弱精組患者精子ERK蛋白表達明顯升高，全方組ERK蛋白表達較補腎組降低更為明顯;與正常組比較，弱精組患者精子P38表達及PP38明顯升高，全方組P38表達及PP38較補腎組降低更為明顯。結論:補腎健脾治法可以改善弱精子癥患者精子活力，可能與抑制p38MAPK/ERK信號通路有關。

加味天雄散;弱精子癥;p38MAPK信號傳導通路

隨著社會競爭壓力的增大和環境污染的日趨嚴重，男性生殖能力呈下降趨勢。世界衛生組織研究發現，大約有15%的婚后夫婦存在不能正常生育的問題［1］，弱精子癥已成為影響男性生育能力的最常見原因［2］。近年來國內外基礎研究發現，ROS(活性氧)產生過多可能是造成男性不育癥的重要病因之一［3］，而ROS是MAPK信號通路強有力的激活劑，在MAPK傳導通路的一些組成成分，如細胞外信號調節激酶(ERK)、P38MAPK信號通路和精子活動力密切相關。我們在既往的臨床和動物實驗研究中發現，補腎健脾類中藥能夠起到抗氧化損傷、提高精子活力的作用。本研究觀察加味天雄散對弱精子癥患者精子的P38MAPK/ERK通路表達的影響，現報道如下。

1 臨床資料

1.1 病例選擇

選取2014年6月至2015年3月就診于天津中醫藥大學第一附屬醫院男科門診的患者，診斷參照《WHO人類精液及精子－宮頸黏液相互作用實驗室檢驗手冊》(第4版)規范，正常禁欲間隔時間內測試2次精液，如果精液量大于3 ml，精子密度超過20×106/ml，A級少于25%或者A+B級少于50%即可診斷為弱精子癥(注:精子活動力分級精子運動級別:A級:快速前向運動精子;B級:慢或呆滯的前向運動精子;C級:非向前運動精子;D級:不動精子)。

1.2 納入標準

符合《人類精液及精子－宮頸黏液相互作用實驗室檢驗手冊》(第4版)標準;男性年齡24～45周歲，病程1～4年;近1年內夫妻感情穩定，有正常的性生活。

1.3 排除標準

年齡＜25周歲或＞45周歲;妻子伴發嚴重的生殖系統疾病;男方伴發性功能障礙，如陽痿、早泄、性欲低下等;男方服用放化療藥物影響生殖能力者;男方合并梗阻性泌尿系統疾病、三度靜脈曲張;并發嚴重的心腦血管病等原發性疾病;嚴重的精神疾患;不符合納入標準或病例記錄不全等影響療效者。

1.4 分組

將弱精子癥患者分為加味天雄散全方組、補腎組、健脾組、弱精癥組4組各30例，并設精液檢查正常者30例。弱精癥組診斷為弱精癥者，無生育要求，并不接受藥物干預治療者，而全方組、補腎組、健脾組3組接受治療。

1.5 治療手段

加味天雄散組成:附子(先煎)6 g，丹參10 g，刺五加10 g，肉蓯蓉10 g，枸杞子20 g，菟絲子15 g，黃芪10 g，白術15 g，制首烏15 g，桂枝10 g，茯苓15 g，龍骨10 g(先煎);補腎組組成:附子6 g(先煎)，丹參10 g，刺五加10 g，肉蓯蓉10 g，枸杞子20 g，菟絲子15 g，制首烏15 g，桂枝10 g，龍骨10 g(先煎);健脾組組成:附子6 g(先煎)，丹參10 g，刺五加10g，黃芪10 g，白術15 g，桂枝10 g，茯苓15 g，龍骨10 g(先煎)。

1.6 療程及服藥方法

中藥飲片采用代煎，由天津中醫藥大學第一附屬醫院制劑室提供，每劑中藥一次性煎至300 ml，分成2袋小包裝，每袋各150 ml，每天2次飯后口服，每次150 ml，加味天雄散全方組、補腎組、健脾組進行治療，3個月為1個療程，共治療1個療程。

1.7 檢測指標

1.7.1 精液常規分析 患者在檢驗前禁欲2～7 d，化驗前注意休息，避免刺激食物，在天津中醫藥大學第一附屬醫院男科取精室完成取精后立即送實驗室恒溫箱。精液分析采用北京中科恒業科技有限公司生產的精液分析儀進行分析，由專業實驗人員完成。

1.7.2 P38MAPK和ERK蛋白表達、磷酸化水平變化 ①蛋白提取:將－196℃液氮中保存的精子取出，迅速置于37℃水浴鍋內解凍，4℃預冷的PBS(0.1 mol/L pH7.4)洗滌3～4次，轉移到玻璃研磨器中，向研磨器中加入細胞裂解液，冰浴研磨裂解10 min，移入準備好的1.5 ml離心管中超速離心4℃、12000 r/min，時間為15 min。將離心后的上清液轉移到另一潔凈的1.5 mlEp管中，測定上清液總蛋白濃度后調整蛋白濃度，將上述上清液與計算后所需要的loading buffer混合，水浴鍋煮沸10 min。②Western印跡檢測:一抗ERK、PERK、P38、PP38抗體購自abcam公司，二抗均購自北京百奧思科生物醫學科技有限公司。操作方法:首先制備 SDSPAGE凝膠，然后10%SDS-PAGE電泳，電泳結束后轉膜到硝酸纖維素膜，一抗過夜后用辣根過氧化物酶標記的二抗對待測蛋白進行孵育、檢測。

將上述膜室溫封閉2 h，PBST液漂洗3次，每次 10 min，分別加入 ERK、P38MAPK、PERK、PP38MAPK抗體(1∶800)4℃孵育過夜。次日以PBST漂洗3次，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶1000)二抗孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10 min，ECL化學發光法顯影。洗去硝酸纖維素膜上結合的一抗、二抗，室溫下以封閉液繼續封閉2 h。內參選用 β-actin抗體(1∶1000)作為一抗，重復Western blot實驗，實驗結束后用Quantity One軟件掃描條帶灰度值。各組中ERK、PERK、P38MAPK、PP38MAPK的表達水平分別用目的蛋白條帶與內參蛋白條帶灰度值比較，ERK、P38MAPK活性分別采用PERK與ERK、PP38MAPK與P38MAPK條帶灰度值之比表示，并使用內參蛋白進行校正。

2 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，一般計量資料采用方差分析，計數資料采用卡方檢驗，等級資料采用秩和檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

3 結果

本次研究中對照組3例、補腎組2例患者失訪，健脾組2例、全方組1例患者因工作調動主動退出本研究，其余患者完成本次研究。其中全方組患者年齡(28.8±3.8)歲，病程(2.9±2.3)年;補腎組患者年齡(28.1±3.9)歲，病程(2.8±2.9)年;健脾組患者年齡(29.1±3.8)歲，病程(3.1±2.3)年;弱精癥組患者年齡(28.2±4.1)歲，病程(2.9±2.2)年;正常組年齡(28.9±3.4)歲，5組研究病例年齡、病程比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

3.1 治療后加味天雄散及其拆方對弱精子癥患者精子活力的變化

表1可見，補腎組、健脾組、全方組與治療前比較，精子活力百分率均上升，差異有統計學意義(P＜0.01);與對照組補腎組、健脾組治療后比較，全方組A級精子和A+B級精子百分率改善更明顯(P＜0.01)，差異有統計學意義。

表1 各組治療前后精子活力比較(±s)

表1 各組治療前后精子活力比較(±s)

注:與同一組治療前比較:*P ＜0.01;與對照組治療后比較:#P＜0.01;與健脾組治療后比較:△P＜0.01;與補腎組治療后比較:$P＜0.05

組 別 例數 時 間 A級精子(%) A+B級精子(%)補腎組 28 治療前13.24±4.98 28.10± 8.45治療后 20.35±7.43* 47.72±12.64*健脾組 28 治療前 14.12±5.215 28.31± 8.14治療后 19.96±8.67* 46.67±12.19*全方組 29 治療前 14.78±4.13 27.31± 8.34治療后 27.26±8.91*#△$ 58.44±13.12*#△$

3.2 加味天雄散治療后患者精子ERK和P38磷酸化和蛋白表達水平的變化

圖1 加味天雄散對弱精子癥患者MAPK信號通路p38的影響

表2圖1、2可見，與正常組比較，弱精組患者精子ERK蛋白表達明顯升高;與弱精組比較，藥物干預組中，補腎組和全方組精子ERK蛋白顯著降低，健脾組無明顯改變，全方組ERK蛋白表達較補腎組降低更為明顯;與正常組比較，弱精組患者精子P38表達及PP38明顯升高;與弱精組比較，藥物干預組中，補腎組和全方組精子ERK蛋白顯著降低，健脾組無明顯改變，全方組P38表達及PP38較補腎組降低更為明顯。

4 討論

隨著環境污染的日益加重和生活壓力的增大，男性不育癥已成為困擾患者和醫生的重要問題，引起人們的廣泛關注，男性不育的發生與精子活動力低下有著直接的關系［4］。引起精子活力低下的病因較多，如生殖道炎癥、精液不液化、精索靜脈曲張、內分泌飲食、藥物性飲食等，還有約20% ～40%的患者尚未發現明確的病因，稱之為特發性，現代醫學并未確切的藥物進行治療［5］。隨著基礎研究的不斷深入，ROS對男性生殖能力的影響目前已被廣為關注，精液中的超氧化物歧化酶可以清除過多的活性氧，否則精子活力會受到影響［6］。活性氧可作為誘發劑，引起細胞信號的傳導，對于線粒體的能量代謝有著重要的作用［7］。氧自由基是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路強有力的激活劑。目前MAPK信號通路對成熟精子調控的報道越來越多，MAPK屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶系列，負責調節細胞的生長、分化及對環境的應激適應等多種重要的細胞生理病理過程。有報道，其家族成員細胞外信號調節激酶(ERK1/2)和P38MAPK參與精子活動力的調節，P38MAPK存在于精子尾部中上段［8］。近年來國內學者也研究發現，ERK和P38MAPK在正常精子和弱精子癥患者精子中均有表達，ERK、P38MAPK蛋白表達水平和P38MAPK磷酸化水平在弱精子癥患者組顯著升高，可見P38MAPK/ERK信號通路與精力活力有著密切關系［9］，可能是引起精子活力低下的原因。

表2 治療后各組精子ERK及P38MAPK灰度值的比較(±s)

表2 治療后各組精子ERK及P38MAPK灰度值的比較(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.05;與弱精組比較:#P＜0.05;與健脾組比較:△P＜0.05;與補腎組比較:$P＜0.05

組 別 ERK/β-actin PERK/β-actin P38/β-actin PP38/β-actin正常組0.44±0.12 0.31±0.12 0.59±0.20 0.32±0.09弱精組 0.77±0.22* 0.30±0.13 0.98±0.22* 0.71±0.13*補腎組 0.58±0.18# 0.29±0.11 0.79±0.19*# 0.58±0.12*#健脾組 0.69±0.21* 0.31±0.09 0.89±0.23* 0.64±0.11*全方組 0.47±0.15#△ 0.32±0.08 0.63±0.21*#△ 0.36±0.08*#△$

圖2 加味天雄散對弱精子癥患者P-ERK通路的影響

圖3 加味天雄散對弱精子癥患者P-P38通路的影響

中醫學在經典著作《黃帝內經》里提出腎主生殖的學說，提出“丈夫二八腎氣盛，天癸至，精氣溢瀉，陰陽和，故能有子”，男性不育癥的治療以補腎為主，我國學者也進行了相關的流行病學研究。大量的病例研究發現，男性不育癥腎虛患者占總病例的61.4%，可見腎虛為男性不育癥發病的主要病機［11］。除腎虛之外，男性不育的發生也與脾相關，因為脾為后天之本，氣血生化之源［12］。我們課題組近年來研究發現，采用脾腎同治能有效提高男性不育癥的臨床療效，證實補腎健脾法療效優于單一補腎法［13］。前期的實驗研究也發現，基于補腎健脾治法的加味天雄散能夠提高少弱精子癥模型大鼠精漿SOD活力，降低精漿MDA水平，提高精漿組織中的抗氧化水平，提高精子的活力［14］。

天雄散出自古籍《金匱要略》，首次在虛勞病中提出脾腎同治，提出對復雜病證治療的重點是補脾胃、建中氣，以達治療疾病的目的。健脾補腎法在加味天雄散組方配伍中有良好的體現，白術、茯苓益氣健脾，肉蓯蓉補腎填精，制首烏補肝腎，菟絲子補腎益精、養肝明目，從而達到脾腎同治的效果。為此我們在本次研究中也進行了拆方研究，分為健脾、補腎、全方組，分別比較3種中醫治法治療弱精子的臨床療效以及對MAKP信號通路的影響。研究發現，與補腎組、健脾組治療后比較，補腎健脾法組A級精子和A+B級精子百分率改善更明顯;與正常組比較，弱精組患者精子ERK蛋白表達明顯升高;與弱精組比較，全方組ERK蛋白表達較補腎組降低更為明顯;與正常組比較，弱精組患者精子P38表達及PP38明顯升高;與弱精組比較，全方組P38表達及PP38較補腎組降低更為明顯。

本研究以不育中最常見的弱精子癥為載體，進行3種中醫治法的比較，發現基于補腎健脾法的加味天雄散可以改善弱精子癥患者精子活力，可能與抑制p38MAPK信號通路有關。從信號傳導通路方向研究探討補腎健脾法治療弱精子癥的作用機制，對于探索研究脾腎同治法的作用機制具有重要意義，對于完善脾腎相關論、促進其理論物質基礎研究、提供相關的實驗依據有著重要的意義。

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R698+.2

B

1006-3250(2016)06-0788-04

2015-10-25

國家自然科學基金青年基金項目(81202695);中國中醫科學院優勢病種資助項目(CACMS08Y0025)

耿 強，河北承德人，主治醫師，醫學碩士，從事中西醫結合男科的臨床與研究。

△通訊作者:郭 軍，主任醫師，博士研究生導師，Tel:010-62835134，E-mail:guojun1126@126.com。