滋腎育胎方劑聯(lián)合雌孕激素序貫療法對(duì)卵巢早衰大鼠的影響

張麗梅，蔡 林

(南充市川北醫(yī)學(xué)院，四川南充 637000)

滋腎育胎方劑聯(lián)合雌孕激素序貫療法對(duì)卵巢早衰大鼠的影響

張麗梅，蔡 林

(南充市川北醫(yī)學(xué)院，四川南充 637000)

目的:研究滋腎育胎方劑聯(lián)合雌孕激素序貫療法對(duì)卵巢早衰大鼠的影響，進(jìn)而探討雌孕激素序貫治療的最適用量。方法:選擇84只Wistar大鼠，12只未作處理列為空白對(duì)照組，72只大鼠為模型組，采用自身免疫性卵巢早衰方法造模。模型組根據(jù)處理方法的不同分為模型對(duì)照組、純激素治療組、純中藥治療組及中藥聯(lián)合激素(全量、半量及1/4量)治療組，每組各12只。比較分析治療3個(gè)療程后各組大鼠性激素、抑制素B及卵巢子宮組織的變化。結(jié)果:中藥聯(lián)合全量激素治療組效果最好，其次為中藥+半量激素組，該組與純激素治療組療效相當(dāng)，中藥聯(lián)合1/4量激素組及純中藥治療組治療效果相對(duì)較差。結(jié)論:滋腎育胎方劑聯(lián)合半量激素組效果較佳，中藥結(jié)合全量或半量激素能夠有效地改善卵巢早衰大鼠卵巢儲(chǔ)備功能，考慮到激素的副作用，半量激素當(dāng)然更好，可以有效地延緩卵巢衰老進(jìn)度，減少雌孕激素用量以及激素引起的副作用。

卵巢早衰;滋腎育胎方;中西醫(yī)結(jié)合;抑制素B;大鼠

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是一種原因尚不明確的原發(fā)性卵巢功能不全，主要表現(xiàn)為婦女在40歲以前卵巢功能表現(xiàn)出減退狀態(tài)，出現(xiàn)月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)等，生化檢測(cè)性激素結(jié)果為腺垂體分泌的卵泡刺激素和黃體生成素明顯升高［1］，發(fā)病率在1%～3%［2］。中醫(yī)證型主癥為月經(jīng)推后或月經(jīng)量少、色淡質(zhì)稀，次癥為腰膝酸軟、神疲乏力、頭暈耳鳴、性欲減退、失眠多夢(mèng)、心悸、少氣懶言等。病因多認(rèn)為與遺傳、環(huán)境等因素有關(guān)，發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前臨床針對(duì)此類患者多采用激素替代療法進(jìn)行治療，目的主要是為改善患者因低雌激素造成的陰道不適等各種圍絕經(jīng)期癥狀，以維持月經(jīng)來(lái)潮，進(jìn)而恢復(fù)生育功能。然而采用純激素序貫治療易增加肝腎功能負(fù)擔(dān)，造成肝腎功能損害，還有促進(jìn)子宮內(nèi)膜過(guò)度生長(zhǎng)、抑制卵巢功能、增加乳腺癌的發(fā)生率等副作用。采用中醫(yī)藥治療可以改善患者的臨床癥狀，穩(wěn)定療效，但單純中藥治療又存在療程較長(zhǎng)、起效相對(duì)較慢、患者依從性較差等不足。

滋腎育胎方劑為我院治療卵巢功能減退或卵巢早衰的臨床經(jīng)驗(yàn)方，20多年來(lái)取得了顯著的臨床療效。本研究采用中藥聯(lián)合雌孕激素序貫療法治療卵巢早衰大鼠，為中西醫(yī)結(jié)合治療卵巢早衰提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選擇清潔級(jí)Wistar大鼠200只，體質(zhì)量約200 g，陰道圖片檢測(cè)示動(dòng)情周期規(guī)律，所有實(shí)驗(yàn)大鼠由川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

滋腎育胎方劑組成:熟地黃20 g，黨參15 g，山藥30 g，山茱萸18 g，菟絲子20 g，川續(xù)斷20 g，炒杜仲20 g，白術(shù)18 g，當(dāng)歸12 g，甘草6 g，黃芩炭6 g。將上述方劑通過(guò)煎汁使藥物濃度保持在3.5 g/ml。戊酸雌二醇又名補(bǔ)佳樂(lè)1mg×21#，法國(guó)先靈公司生產(chǎn))，醋酸甲羥孕酮片(2mg×100#，浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn))。佐劑為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品分裝，分為弗氏完全佐劑(complete Freund’sadjuva nt，CFA)、弗氏不完全佐劑 (incomplete Freund’sadjuvant，IFA)。

1.3 方法

1.3.1 造模 根據(jù)參考文獻(xiàn)［3］制備卵巢早衰大鼠模型。首先制備卵巢抗原，切取體質(zhì)量大約為200 g Wistar雌性大鼠的卵巢組織進(jìn)行稱重，生理鹽水漂洗，Tris-HCl緩沖液中將漂洗干凈的卵巢組織剪碎并研磨成勻漿，超聲粉碎機(jī)低溫下粉碎約5 min，4000 r/min低溫離心15 min，10000 r/min離心5 min，吸管吸取上清液，將卵巢組織液濃度調(diào)至200 mg/ml。隨機(jī)選擇100只Wistar雌性大鼠進(jìn)行多點(diǎn)多處皮下注射卵巢抗原，注射劑量為每只大鼠70 mg(0.35 ml)，連續(xù)進(jìn)行3次注射，每2周1次。第1次免疫加入相同劑量的CFA，第2、3次加入相同劑量的IFA;對(duì)照組(12只)給予相同劑量的生理鹽水代替卵巢抗原。大鼠動(dòng)情周期采用陰道涂片的方法進(jìn)行檢測(cè)，若大鼠動(dòng)情周期延長(zhǎng)或出現(xiàn)明顯紊亂說(shuō)明造模成功。

1.3.2 分組及給藥 空白對(duì)照組大鼠12只。選擇造模成功的72只Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組、純激素治療組、純中藥治療組及中藥聯(lián)合全量激素組，中藥聯(lián)合半量激素組，中藥聯(lián)合1/4量激素治療組。模型對(duì)照組大鼠給予20 ml/ (kg·d)蒸餾水灌胃;純激素治療組給予補(bǔ)佳樂(lè)0.12 mg/(kg·d)，同時(shí)給予蒸餾水20 ml/(kg·d)進(jìn)行灌胃，補(bǔ)佳樂(lè)灌胃治療4d后給予醋酸甲羥孕酮0.96 mg/(kg·d)聯(lián)合治療，10 d后停藥，停藥1 d后開始下一周期治療;純中藥治療組給予滋腎育胎方劑20 ml/(kg·d)灌胃;中藥聯(lián)合不同劑量激素組給予相同劑量中藥灌胃，同時(shí)給予全量、半量及1/4量醋酸甲羥孕酮，連續(xù)用藥14 d，3個(gè)療程后檢測(cè)各組性激素、抑制素B蛋白水平。

1.3.3 檢測(cè)方法 藥物治療3個(gè)療程后，取處于動(dòng)情間期Wistar大鼠腹主動(dòng)脈血，離心分離血清冷凍儲(chǔ)存，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)E2、FSH、LH水平;摘除取血后的大鼠雙側(cè)卵巢進(jìn)行稱重，一側(cè)卵巢做成病理切片并進(jìn)行HE染色，常規(guī)光鏡下觀察染色后的病理切片，詳細(xì)觀察并記錄卵巢組織的形態(tài)學(xué)變化。摘除另一側(cè)卵巢采用免疫組化法測(cè)定抑制素B表達(dá)量，免疫組化圖像采用Image-Pro Plus軟件處理，根據(jù)圖像的灰階度進(jìn)行雙閾值分割，以得到半灰度目標(biāo)圖像，并根據(jù)陽(yáng)性免疫染色強(qiáng)度及面積進(jìn)行測(cè)定。每只大鼠標(biāo)本測(cè)定5個(gè)視野，由計(jì)算機(jī)計(jì)算出所測(cè)陽(yáng)性反應(yīng)物相對(duì)含量的積分光密度值;所有大鼠子宮摘除并稱重，經(jīng)HE染色光鏡下觀察子宮組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠性激素水平及卵巢、子宮濕重比較

表1顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組FSH、LH水平明顯升高，E2水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。純激素治療組、純中藥治療組、中藥+全量激素、中藥+半量激素、中藥+1/4量激素各組血清FSH、LH水平較模型對(duì)照組均降低、而E2水平均升高(P＜0.05)。與純激素治療組比較，中藥+全量激素組血清FSH、LH明顯降低，E2顯著升高(P＜0.05);中藥+半量激素組血清FSH、LH、E2輕度升高(P＞0.05);中藥+1/4量激素組及純中藥治療組FSH、LH明顯升高(P＜0.05)，而與E2水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組卵巢、子宮濕重均降低(P＜0.05)。中藥+全量激素組卵巢、子宮濕重較模型對(duì)照組及純激素治療組均增加(P＜0.05)。中藥+半量激素組及純激素治療組卵巢濕重較模型對(duì)照組均增加(P＜0.05)，與子宮濕重比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。中藥+1/4量激素組及純中藥治療組卵巢、子宮濕重與模型對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠性激素水平及卵巢、子宮濕重分析(±s)

表1 各組大鼠性激素水平及卵巢、子宮濕重分析(±s)

注:與空白對(duì)照組比較:★P＜0.05;與模型對(duì)照組比較:●P＜0.05;與純激素治療組比較:▲P＜0.05

組別 鼠數(shù) FSH(IU/L) LH(ng/L) E2(ng/L) 卵巢(g) 子宮(g)空 白 對(duì) 照 組 12 4.089±0.223 15.395±0.821 55.768±1.941 0. 0.112±0.139 0.426±0.133 137±0.006 0.541±0.109模 型 對(duì) 照 組 12 7.489±0.341★ 27.232±1.397★ 37.301±1.425★ 0.113±0.012★ 0.371±0.062★純 激 素 治 療 組 12 5.200±0.225● 18.065±0.623● 43.791±1.411● 0.128±0.015● 0.412±0.111純 中 藥 治 療 組 12 6.871±0.301●▲ 23.411±0.916●▲ 42.503±7.191● 0.116±0.012 0.428±0.107中藥+全量激素組 12 4.481±0.231●▲ 16.125±0.783●▲ 53.872±1.603●▲ 0.133±0.012●▲ 0.551±0.112●▲中藥+半量激素組 12 5.453±0.201● 19.303±0.837● 45.779±1.201● 0.127±0.007● 0.438±0.091中藥+1/4量激素組 12 6.058±0.237●▲ 21.353±0.936●▲ 42.397±1.532●

2.2 各組大鼠卵巢INHB蛋白表達(dá)

表2顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組卵巢INHB蛋白表達(dá)量明顯降低(P＜0.05)。純激素治療組、中藥+全量激素治療組、中藥+半量激素組卵巢INHB蛋白表達(dá)量明顯高于模型對(duì)照組(P＜0.05)。

表2 各組卵巢INHB蛋白表達(dá)比較

3 討論

腎藏精，主生殖，乃先天之本，腎中充滿精氣，天癸成熟則月經(jīng)來(lái)潮，能孕育子女，說(shuō)明卵巢生殖周期開始;腎精衰竭、天癸耗竭出現(xiàn)經(jīng)閉，則說(shuō)明女性卵巢生殖功能處于衰竭狀態(tài)，因此女性卵巢功能的狀態(tài)與腎臟息息相關(guān)。脾為后天之本，氣血生化之源，月經(jīng)正常與否與脾腎功能有明顯的相關(guān)性。

目前，臨床對(duì)卵巢早衰患者維持正常月經(jīng)一般采用中藥聯(lián)合雌孕激素序貫療法進(jìn)行治療，這種治療方法對(duì)患者的精神狀態(tài)有重要的調(diào)節(jié)作用，還能維持患者正常的夫妻關(guān)系。通過(guò)外源性補(bǔ)充雌孕激素治療卵巢早衰患者，能夠通過(guò)反饋調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素的分泌，從而達(dá)到降低血清中垂體分泌的FSH、LH水平，維持正常月經(jīng)周期，延緩卵巢衰老的目的，也能夠有效改善患者的更年期癥狀及提高生活質(zhì)量。

滋腎育胎方劑全方由熟地黃、黨參、山藥、山茱萸、菟絲子、川續(xù)斷、炒杜仲、白術(shù)、當(dāng)歸、甘草、黃芩炭組成，該方劑具有健脾補(bǔ)腎、益培元?dú)饧梆B(yǎng)血穩(wěn)胎的作用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，滋腎育胎方劑能夠使實(shí)驗(yàn)兔性腺和性器官的血液供應(yīng)增加并促進(jìn)卵泡和黃體發(fā)育［4］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，使用滋腎育胎方劑后患者孕酮分泌增加，IVF-ET胚胎種植率提高［5］，均表明滋腎育胎方劑對(duì)卵巢功能有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究探討滋腎育胎方劑聯(lián)合雌孕激素序貫療法對(duì)卵巢早衰大鼠卵巢功能的影響，結(jié)果顯示中藥聯(lián)合全量激素治療組效果最好，其次為中藥+半量激素組，該組與純激素治療組療效相當(dāng)。純中藥治療效果欠佳可能與本次實(shí)驗(yàn)療程較短有關(guān)。本研究從激素結(jié)果顯示，滋腎育胎方劑聯(lián)合不同劑量雌孕激素序貫療法能有效抑制卵巢功能衰竭進(jìn)程，滋腎育胎方劑在提高療效的同時(shí)，可以有效減少激素用量，降低副作用。另外，子宮、卵巢質(zhì)量在中藥聯(lián)合半量、中藥聯(lián)合1/4量激素時(shí)與空白對(duì)照組比較基本無(wú)變化，提示在使用中藥的同時(shí)減少雌激素用量能夠達(dá)到同樣的調(diào)節(jié)效果。

INHB是性腺分泌的重要激素，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β中的一員，INHB主要在育齡期婦女卵巢組織中的顆粒細(xì)胞內(nèi)表達(dá)［6］。INHB主要作用于腺垂體，通過(guò)反饋性作用抑制FSH、LH分泌。有學(xué)者研究認(rèn)為，INHB評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能較FSH等其他指標(biāo)敏感性較強(qiáng)，是評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能的重要指標(biāo)［7-8］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠卵巢INHB蛋白表達(dá)量明顯降低，中藥聯(lián)合不同劑量雌孕激素能在不同程度上促進(jìn)卵巢INHB蛋白水平的表達(dá)，其中中藥+全量激素與中藥+半量激素療效相當(dāng)，說(shuō)明運(yùn)用滋腎育胎方劑有助于在減少激素用量的同時(shí)提高卵巢早衰大鼠的卵巢儲(chǔ)備功能。

綜上所述，根據(jù)本研究結(jié)果顯示滋腎育胎方劑聯(lián)合半量激素組效果較佳，中藥結(jié)合全量或半量激素能夠有效地改善卵巢早衰大鼠卵巢儲(chǔ)備功能，考慮到激素的副作用，半量激素當(dāng)然是更好的，這樣可以有效地延緩卵巢衰老進(jìn)度，減少雌孕激素用量以及激素引起的副作用。

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R285.5

A

1006-3250(2016)06-0785-03

2015-09-26

張麗梅(1976-)，女，四川眉山人，副教授，醫(yī)學(xué)碩士，從事中醫(yī)婦科的臨床與研究。