甲狀腺乳頭狀癌組織中BRAF基因突變及CyclinD1蛋白表達的臨床意義

盧軍峰，解乃昌，馬艷紅，段友良，徐良

(1山東省交通醫院，濟南250031；2廣西醫科大學第一附屬醫院)

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·臨床研究·

甲狀腺乳頭狀癌組織中BRAF基因突變及CyclinD1蛋白表達的臨床意義

盧軍峰1，解乃昌2，馬艷紅1，段友良1，徐良1

(1山東省交通醫院，濟南250031；2廣西醫科大學第一附屬醫院)

摘要：目的觀察甲狀腺乳頭狀癌(PTC)組織中BRAF基因突變及細胞周期調控基因蛋白(CyclinD1)表達情況，探討其臨床意義。方法采用聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性技術檢測115例PTC組織中BRAF基因，通過DNA序列分析計算基因突變率；采用免疫組織化學技術檢測CyclinD1蛋白。結果本組BRAF基因突變率為48.7%(56/115)，CyclinD1蛋白陽性表達率為65.2%(75/115)；頸淋巴結轉移陽性與陰性者BRAF基因突變率分別為73.5%(25/34)、38.3%(31/81)，P=0.001； CyclinD1蛋白陽性表達率分別為70.6%(24/34)、63.0%(51/81)，P=0.522；BRAF基因突變者CyclinD1蛋白陽性表達率為80.4%(45/56)，BRAF基因野生型者CyclinD1蛋白陽性表達率為50%(30/59)，二者比較P=0.002。結論BRAF基因突變及CyclinD1蛋白陽性表達對PTC的發生、發展起促進作用，二者對評估PTC患者的預后及術后復發的綜合治療效果有一定臨床價值。

關鍵詞：甲狀腺癌；BRAF基因；細胞周期蛋白D1；免疫組織化學技術

近幾年眾多學者在甲狀腺乳頭狀癌(PTC)分子生物學研究中檢測到高頻率的BRAF基因突變。研究發現，BRAF基因第15位外顯子上T1799A(曾被認為是T1796A)位突變可導致BRAF中的纈氨酸(V)被谷氨酸(E)替代(V600E)，使一系列蛋白激酶異常激活，進而促進細胞異常增殖并導致腫瘤形成[1]。有研究認為，腫瘤的發生、發展是一種細胞周期疾病，細胞因子調控異常，導致細胞進入病理狀態異常增殖而發生腫瘤；G1期調節中，細胞周期調控正性因子CyclinD1的過度表達引起細胞的失控性生長，從而導致腫瘤的發生[2,3]。本研究分析PTC組織中BRAF基因突變及CyclinD1蛋白表達情況，探討其在PTC臨床診斷及治療中的價值。

1資料與方法

1.1臨床資料收集2002年9月~2013年3月山東省交通醫院及廣西醫科大學第一附屬醫院病理科存檔的PTC蠟塊標本115份，術后和實驗前均經兩位病理科主任醫師再次確診。患者男24例、女91例，年齡17~76歲、平均45歲；均為首次手術且術前未行放射碘治療。手術方式：患側全切+峽部切除(癌灶<1.0 cm，包膜內，無淋巴結轉移且位于上極)32例，患側全切+峽部切除+對側大部分切除(癌灶>1.0 cm，包膜內且位于下極)49例，甲狀腺次全切除術(浸出包膜、遠處轉移或多個癌灶)13例，甲狀腺全切除術及頸部淋巴結清掃(雙側癌灶或有淋巴結轉移)21例。TNM分期：T1~3N0M0期81例，T1~3N1M0期34例。

1.2觀察方法

1.2.1BRAF基因突變檢測采用聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性(PCR-SSCP)技術。PTC組織中BRAF基因的提取、擴增、瓊脂糖凝膠電泳、PCR-SSCP檢測、序列分析由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。對有異常泳動條帶標本的PCR擴增產物行DNA測序，BRAF基因第15外顯子發生T-1799-A替換，突變測序圖出現雙峰為發生BRAF基因突變。

1.2.2CyclinD1蛋白表達測定采用免疫組化SP法。CyclinD1蛋白陽性表達定位于細胞核，胞質多伴有微弱染色，僅胞質染色則視為陰性；在同一光強亮度下，陽性判斷標準參照Takahashi等的方法，同一高倍鏡下(×400倍)每張切片隨機選取10個視野進行拍照計數。陽性細胞染色程度淡黃色為1分，橙黃色為2分，棕褐色為3分；陽性著色細胞百分比≤5%為0分，5%<~25%為1分，25%<~50%為2分，>50%為3分；兩項染色結果評分的乘積分值<2分為陰性，≥2分為陽性。

1.2.3統計學方法采用SPSS13.0統計軟件。計數資料以率表示，比較用四格表χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1BRAF基因突變情況本組56例標本出現異常的SSCP泳動條帶，BRAF基因突變率為48.7%(56/115)，見圖1。DNA測序顯示，第15外顯子發生T-1799-A替換，突變測序圖出現了雙峰，見插頁Ⅲ圖9；BRAF基因野生型測序圖未見雙峰，見插頁Ⅲ圖10。

注：1、3、5為對照組織；2、4、6為PTC組織。

2.2CyclinD1蛋白表達情況本組CyclinD1蛋白陽性表達率為65.2%(75/115)。見插頁Ⅲ圖11。

2.3頸淋巴結轉移者BRAF突變及CyclinD1蛋白表達情況本組頸淋巴結轉移陽性及陰性患者BRAF基因突變率分別為73.5%(25/34)、38.3%(31/81)；P=0.001；CyclinD1蛋白陽性表達率分別為70.6%(24/34)、63.0%(51/81)，P=0.522。

2.4PTC組織中BRAF突變與CyclinD1蛋白表達的相關性56例BRAF基因突變者CyclinD1蛋白陽性表達率為80%(45/56)，BRAF基因野生型CyclinD1蛋白表達陽性率為50%(30/59)；二者比較，P=0.002。

3討論

BRAF基因又名鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1，是RAF基因的家族成員，位于人染色體7q34，含18個外顯子，編碼蛋白質分子全長約94 kD，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白質激酶類，是MAPK激酶家族里最高效的磷酸化劑，在細胞凋亡和增殖過程中起重要作用，其位于MAPK通路入口處，將細胞表面的受體和RAS蛋白通過MEK和ERK與核內的轉錄因子相連接，調節細胞的生長、發育。BRAF突變最初是在Davies等[4]的惡性黑色素瘤的研究中被發現。國外大量研究表明，BRAF突變同樣發生于甲狀腺癌，且發生率僅次于黑色素瘤，提示BRAF基因突變型PTC的組織侵襲性更高，容易浸潤甲狀腺周圍組織，臨床分期更晚[5，6]。

CyclinD1是G1期周期素，在G1期調節中其為重要的G1/S期轉換正向調控因子，使細胞從G1期向S期轉化。CyclinD1的過度表達將導致G1期縮短并提前進入S期，使細胞增殖失控，最終導致腫瘤發生。近年來研究發現，CyclinD1在腫瘤中的過表達與細胞侵襲能力有關，在甲狀腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌等腫瘤組織中CyclinD1過表達與淋巴結轉移有關，CyclinD1過表達的腫瘤組織更具有侵襲力和更高的淋巴結轉移率[7，8]。

本研究中納入的115例PTC標本皆為分化型甲狀腺乳頭狀癌，BRAF基因突變檢出率(48.7%)與汪杰等[9]報道的(29%~83%)一致。研究發現，PTC原發灶和轉移淋巴結中常檢測到BRAF基因突變，Meta分析研究結果顯示，BRAF基因突變型PTC的組織侵襲力高，容易浸潤甲狀腺周圍組織，臨床病理分期高；包膜受侵犯或者發生淋巴結轉移的PTC與無轉移灶的PTC相比，BRAF基因突變率更高[10]。本研究CyclinD1陽性表達率為65.2%，PTC頸淋巴結轉移與否與CyclinD1表達無明顯關系。BRAF基因突變者PTC組織中CyclinD1呈過高表達，CyclinD1表達上調與BRAF基因突變呈正相關，二者對PTC臨床病理預后風險評估體系的參數(如AGES、AMES、MACIS、UICC-TNM分期)將起到很好的補充作用，可作為PTC臨床病理診斷的重要輔助指標，亦可作為評估PTC侵襲能力、臨床手術方式的選擇、術后輔助放療指導等的重要參數。

綜上所述，PTC的演變與BRAF基因突變關系密切，BRAF基因突變可作為PTC頸淋巴結轉移危險因素的評估指標，其突變多提示PTC預后不良。CyclinD1高表達是PTC一個較早的分子事件，其與BRAF基因突變具有協同作用，可促進PTC的發生、發展；對評估PTC患者的預后具有一定的參考價值。

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(收稿日期：2015-05-06)

中圖分類號：R736.1

文獻標志碼：B

文章編號：1002-266X(2016)04-0036-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.04.012

基金項目：廣西自然科學基金資助項目(桂科自0728132)。