PDX-1基因克隆載體的體外構(gòu)建

汪珊珊，陳明衛(wèi)

(1安徽省第二人民醫(yī)院，合肥230000；2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

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PDX-1基因克隆載體的體外構(gòu)建

汪珊珊1，陳明衛(wèi)2

(1安徽省第二人民醫(yī)院，合肥230000；2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

摘要：目的體外構(gòu)建胰-十二指腸同源框-1(PDX-1)基因的克隆載體。方法采用TRIzol方法從大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞株中提取RNA，通過(guò)RT-PCR方法在體外擴(kuò)增大鼠PDX-1 cDNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，割膠純化后回收目的基因，與pMD-18T克隆載體連接構(gòu)建，經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切及DNA序列分析鑒定pMD-18T-PDX-1的正確構(gòu)建。結(jié)果正確構(gòu)建了含有PDX-1 cDNA的克隆載體pMD-18T-PDX-1，其中PDX-1 cDNA全長(zhǎng)為908 bp。將經(jīng)雙酶切鑒定正確的pMD-18T-PDX-1細(xì)菌克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)定結(jié)果與GenBank中大鼠PDX-1基因序列(NM_022852.3)一致。結(jié)論成功構(gòu)建了PDX-1基因克隆載體。該載體可為PDX-1基因分子生物學(xué)研究及PDX-1基因在誘導(dǎo)非β細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化中作用機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：胰-十二指腸同源框-1；cDNA；胰島細(xì)胞瘤；克隆載體

近年來(lái)，胰-十二指腸同源框-1(PDX-1)在胰腺的發(fā)育、分化、再生及胰島素分泌過(guò)程中的作用受到廣泛關(guān)注。PDX-1屬于器官同源結(jié)構(gòu)域蛋白，研究發(fā)現(xiàn)PDX-1基因與胰腺發(fā)育至關(guān)重要，不僅可促進(jìn)胰腺早期發(fā)育和晚期胰島β細(xì)胞的分化，還可促進(jìn)胰島素、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2及胰島淀粉樣多肽的轉(zhuǎn)錄，甚至與胰島的再生有關(guān)，可作為胰腺干細(xì)胞的特異性標(biāo)志之一。此外，PDX-1還參與延緩β細(xì)胞的自身凋亡。因此，PDX-1基因在胰島素正常分泌過(guò)程中不可缺少[1~5]。為進(jìn)一步探討PDX-1基因的功能及應(yīng)用前景，本研究采用基因工程方法從體外提取大鼠胰島細(xì)胞瘤的RNA，經(jīng)RT-PCR技術(shù)，獲得大鼠PDX-1基因的cDNA，進(jìn)一步構(gòu)建大鼠PDX-1基因的克隆載體pMD-18T-PDX-1。

1材料與方法

1.1材料pMD18-T載體(TaKaRa)；大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)；大腸桿菌DH5α(華舜生物工程有限公司)；RT-PCR試劑盒(Fermentas)；PCR純化和膠回收試劑盒(Tiangen)；質(zhì)粒提取試劑盒(Fermentas)；TRIzol(Invitrogen)；氯仿、異丙醇、乙醇、胰蛋白胨、酵母提取物(上海生物工程公司)；瓊脂糖、胰蛋白酶(Sigma)；限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ及DNA DL2000 marker(TaKaRa)。

1.2方法

1.2.1大鼠RNA的提取培養(yǎng)大鼠胰島瘤細(xì)胞，待培養(yǎng)至貼壁80%~90%時(shí)，棄舊培養(yǎng)液，并用PBS洗滌細(xì)胞2次。經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，使細(xì)胞脫離瓶壁，呈懸浮狀態(tài)。轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，1 000 r/min離心5 min；棄上清液，加入1 mL TRIzol，反復(fù)吹打；移至1.5 mL Eppendorf管內(nèi)，室溫靜置5 min；向Eppendorf管內(nèi)加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min；4 ℃ 12 000 r/min離心15 min；吸取上清液，移入另一個(gè)高壓滅菌的Eppendorf管內(nèi)；向上清液內(nèi)加入適當(dāng)異丙醇(與上清液比例為1∶1)，上下混勻30 s，靜置10 min；4 ℃ 12 000 r/min離心10 min；棄上清液，加入1 mL 75%乙醇，混勻30 s；4 ℃ 7 500 r/min離心5 min；棄上清液，室溫下干燥5~10 min；加入20 μL無(wú)RNA酶的水，并吹打混勻，55~60 ℃放置10 min，使RNA水解，后放置于-80 ℃保存。取5 μL大鼠RNA溶液溶于495 μL去離子水中，混勻，使用分光光度計(jì)測(cè)定A260、A280吸光度值，以計(jì)算RNA濃度。

1.2.2大鼠PDX-1基因的cDNA合成根據(jù)GenBank中大鼠PDX-1基因的mRNA序列(NM_022852.3)，選用Primer5.0軟件在閱讀框架兩側(cè)設(shè)計(jì)上下游引物：上游引物：5′-GGCTGCCACCATGAATAGTG-3′，下游引物：5′-ATGCCCATGTCCGCACTCTG-3′。以大鼠胰島細(xì)胞瘤mRNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增長(zhǎng)度為908 bp。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包含DEPC-H2O 8 μL，Oligo(dT)181 μL，RNA溶液3 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，RiboLockTM RNase Inhibitor(20 U/μL) 1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，Revert AidTM M-MuLV Reverse Transcriptuse(200 U/μL) 1 μL。PCR反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包含大鼠胰島細(xì)胞瘤cDNA第一鏈4 μL，10×PCR buffer(含MgCl2) 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，上游引物(10 μmol/μL)2 μL，下游引物(10 μmol/μL)2 μL，DEPC-H2O 32 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)30次，終末延伸72 ℃ 10 min，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物10 μL，以DL 2000 Marker為對(duì)照，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有無(wú)目的條帶出現(xiàn)。

1.2.3pMD-18T-PDX-1克隆載體的構(gòu)建在紫外觀察燈下，用滅菌的鋒利刀片切取目的片段，按照膠回收與純化試劑盒說(shuō)明書，回收膠中目的片段，并進(jìn)行純化。將得到的PDX-1 cDNA純化物與pMD-18T克隆載體進(jìn)行連接，連接體系包含：pMD18-T Vector 1 μL，PDX-1 cDNA 2 μL，dH2O 2 μL，5 μL SolutionⅠ。連接條件為16 ℃反應(yīng)30 min。將pMD-18T-PDX-1連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至制備好的感受態(tài)大腸桿菌DH5α，將轉(zhuǎn)化后的DH5α均勻涂于20 mL含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基瓊脂平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，以篩選陽(yáng)性克隆。對(duì)篩選的陽(yáng)性克隆按照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行抽提純化。

1.2.4pMD-18T-PDX-1克隆載體的鑒定選取目的基因(PDX-1基因)片段中不存在，但在克隆載體(pMD-18T)插入目的基因片段前、后存在的酶切位點(diǎn)，如BamH Ⅰ和Hind Ⅲ。用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切克隆載體，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳結(jié)果。同時(shí)將經(jīng)雙酶切鑒定正確的pMD-18T-PDX-1細(xì)菌克隆送交上海生物工程有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，并將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的PDX-1 cDNA序列進(jìn)行對(duì)比。

2結(jié)果

2.1RNA的定量取5 μL大鼠RNA溶液溶于495 μL去離子水中，混勻，使用分光光度計(jì)測(cè)定A260、A280吸光度值，以計(jì)算RNA濃度。A260=0.642，A280=0.308，A260/A280=2.084，表明RNA純度較高。RNA濃度(μg/μL)=(A260×40×稀釋倍數(shù))/1 000=A260×4=2.568 μg/μL。

2.2PDX-1基因RT-PCR擴(kuò)增以大鼠胰島細(xì)胞瘤RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳可見一條約900 bp大小的特異性條帶，與預(yù)期的目的基因片段(908 bp)大小一致，說(shuō)明該條帶為預(yù)期的目的基因片段。見圖1。

注：1為PDX-1基因；2為marker。

2.3PDX-1基因克隆載體的雙酶切鑒定將重組克隆載體pMD-18T-PDX-1，分別經(jīng)BamH Ⅰ單酶切、Hind Ⅲ單酶切，及同時(shí)經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳可見單酶切產(chǎn)生1個(gè)條帶，代表已經(jīng)切開的線性化重組克隆載體pMD-18T-PDX-1，而雙酶切產(chǎn)生2個(gè)條帶，其中較小片段位于1 000 bp左右處，代表插入的PDX-1基因片段，較大片段位于2 500 bp左右處，為線性化的pMD-18T載體。見圖2。

2.4PDX-1基因克隆載體的序列分析將經(jīng)雙酶切鑒定正確的pMD-18T-PDX-1細(xì)菌克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)定結(jié)果與GenBank中大鼠PDX-1基因序列(NM_022852.3)一致，表明大鼠PDX-1基因已成功克隆到pMD-18T克隆載體中。見插頁(yè)Ⅱ圖8。

注：M為marker；1為未經(jīng)酶切的重組克隆載體pMD-18T-PDX-1；2為重組克隆載體pMD-18T-PDX-1經(jīng)BamH Ⅰ單酶切后的產(chǎn)物；3為重組克隆載體pMD-18T-PDX-1經(jīng)Hind Ⅲ單酶切后的產(chǎn)物；4為重組克隆載體pMD-18T-PDX-1經(jīng)BamH Ⅰ及Hind Ⅲ雙酶切后的產(chǎn)物。

圖2重組克隆載體pMD-18T-PDX-1的酶切鑒定分析

3討論

PDX-1基因除可誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞之外，還可誘導(dǎo)肝細(xì)胞、肝內(nèi)導(dǎo)管上皮細(xì)胞、成肌細(xì)胞等其他細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化[6~12]。因此，在糖尿病細(xì)胞治療領(lǐng)域，以PDX-1為基礎(chǔ)的基因工程技術(shù)可彌補(bǔ)胰腺移植的供體不足問題。

基于PDX-1基因在胰腺發(fā)育及β細(xì)胞分化表達(dá)中的重要作用，本研究從大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞株中提取RNA，以mRNA為模板，經(jīng)RT-PCR技術(shù)克隆大鼠PDX-1基因的cDNA，并在體外構(gòu)建PDX-1基因克隆載體pMD-18T-PDX-1，經(jīng)雙酶切電泳及DNA測(cè)序分析，證明PDX-1基因已成功克隆到pMD-18T克隆載體中。

本研究所使用的大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞株在體外培養(yǎng)具有高生長(zhǎng)率、穩(wěn)定性較好的特點(diǎn)。因胰腺含有大量?jī)?nèi)源性的RNA酶，從胰腺提取RNA易導(dǎo)致降解而失敗，而從大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞株中提取RNA，減少了內(nèi)源性RNA酶對(duì)RNA的降解作用。在本研究中，選取TRIzol試劑提取細(xì)胞中的RNA。TRIzol試劑可直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA，且具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短的特點(diǎn)，在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性，加入氯仿后離心，樣品可分成水樣層和有機(jī)層，RNA存在于其中的水樣層中。通過(guò)收集水樣層后，加入異丙醇沉淀來(lái)還原RNA，再通過(guò)加入乙醇沉淀能析出其中的DNA，避免對(duì)RNA提取的污染。故本實(shí)驗(yàn)選

取從大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞株中用TRIzol試劑提取RNA，所提取的RNA經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280大于2，表明RNA純度較高。本研究在體外成功構(gòu)建了PDX-1基因的克隆載體。該載體為PDX-1基因分子生物學(xué)研究及PDX-1基因在誘導(dǎo)非β細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化中作用機(jī)制的研究提供了基礎(chǔ)。

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(收稿日期：2015-09-24)

中圖分類號(hào)：R587

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)04-0031-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.04.010

基金項(xiàng)目：安徽省教育廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(KJ2012Z192)。