精子質(zhì)量對不孕不育患者輔助生殖技術(shù)選擇的指導(dǎo)作用

肖鑫，李大文，馮剛，成俊萍，何泳志

(1寧波市泌尿腎病醫(yī)院，浙江寧波 315100；2 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院；3廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院)

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精子質(zhì)量對不孕不育患者輔助生殖技術(shù)選擇的指導(dǎo)作用

肖鑫1，李大文2，馮剛3，成俊萍2，何泳志3

(1寧波市泌尿腎病醫(yī)院，浙江寧波 315100；2 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院；3廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院)

摘要：目的探討精子質(zhì)量對不孕不育患者輔助生殖技術(shù)選擇的指導(dǎo)作用。方法選擇201對行常規(guī)體外受精胚胎移植術(shù)(IVF-ET)的不孕不育夫婦，其中行IVF-ET成功(二極體的胚胎數(shù)量占胚胎總數(shù)≥30%)者126對(IVF-ET組)，IVF-ET失敗(二極體的胚胎數(shù)量占總胚胎數(shù)<30%)后行補(bǔ)救卵胞漿內(nèi)單精子注射術(shù)(R-ICSI)75對(R-ICSI組)。比較兩組精液常規(guī)、精子DNA完整率、精子頂體完整率、頂體反應(yīng)率；體外受精后比較兩組受精率、優(yōu)胚胎率。結(jié)果IVF-ET組精子密度、活力及正常形態(tài)率均高于R-ICSI組(P均<0.05)；R-ICSI組精子DNA斷裂指數(shù)(DFI)明顯高于IVF-ET組(P<0.05)，頂體完整率、頂體反應(yīng)率兩組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)；R-ICSI組受精率、優(yōu)胚率低于IVF-ET組(P均<0.05)。結(jié)論當(dāng)精子密度低于11.1×106/mL，正常形態(tài)率低于1.4%，DFI高于15.9%，頂體完整率低于77.3%，頂體反應(yīng)率低于15.7%時建議直接行R-ICSI助孕。

關(guān)鍵詞：常規(guī)體外受精胚胎移植術(shù)；補(bǔ)救卵胞漿內(nèi)單精子注射術(shù)；精液質(zhì)量；受精能力

近年來，隨著人類輔助生殖醫(yī)學(xué)的發(fā)展， 常規(guī)體外受精胚胎移植術(shù)(IVF-ET)及卵胞漿內(nèi)單精子注射術(shù)(ICSI)成為人類重要的輔助生殖技術(shù)。ICSI最早是在20世紀(jì)90年代后期進(jìn)行嘗試作為對常規(guī)體外受精(IVF)患者體外受精率低下或受精完全失敗的一種補(bǔ)救措施,又稱為補(bǔ)救ICSI(R-ICSI)[2]。根據(jù)精子各項參數(shù)及精子功能選擇合適的輔助生殖技術(shù)是近年來生殖醫(yī)學(xué)研究的熱點及難點。本研究觀察行R-ICSI與IVF-ET的男性精液各項指標(biāo)及受精率、優(yōu)胚率的差異，以指導(dǎo)臨床選擇輔助生殖技術(shù)。

1臨床資料

1.1基本資料選擇2013年6月～2014年6月在廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖中心就診的不孕不育夫婦201對。納入標(biāo)準(zhǔn)：男方：①年齡≤40周歲；②臨床確診為不育癥，體檢未發(fā)現(xiàn)睪丸、附睪及輸精管有明顯異常，無其他合并癥；③婚后性生活正常，不避孕1年以上不育。女方：①年齡≤38周歲；②存在單純性輸卵管因素，其他檢查無異常；③進(jìn)行常規(guī)促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)長方案治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①男方存在泌尿生殖系統(tǒng)急性感染、性傳播疾病；②男方存在先天畸形，如精路梗阻、睪丸萎縮(包括附睪)、染色體異常、精索靜脈曲張Ⅱ度以上；③家族遺傳病及染色體異常；④合并心血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等疾病。其中行IVF-ET成功(二極體的胚胎數(shù)量占胚胎總數(shù)≥30%)者126對(IVF-ET組)，IVF-ET失敗(二極體的胚胎數(shù)量占總胚胎數(shù)<30%)后行R-ICSI者75對(R-ICSI組)。IVF-ET組男(28.44±2.20)歲、女(27.55±2.32)歲，不孕不育病程(6.22±2.71)年，采卵(10.37±4.22)枚；R-ICSI組男(28.55±2.24)歲、女(27.81±2.52)歲，不孕不育病程(5.60±2.47)年，采卵(11.05±5.02)枚。兩組一般資料比較均具有可比性。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者本人均知情并簽署同意書。

1.2精子質(zhì)量檢測兩組行IVF-ET前采用手淫法取精液，采用直接上游法加非連續(xù)密度梯度法洗滌精子后檢測精子質(zhì)量。 ①精子密度：參照《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版，使用計算機(jī)精子輔助分析(CASA) 系統(tǒng)測定精子密度。②精子活力：使用CASA系統(tǒng)測定精子活力。③精子形態(tài)：采用Diff-Quick染色法分析精子形態(tài)，計算精子形態(tài)正常率。④精子DNA完整性、頂體完整率及頂體反應(yīng)率：采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗檢查精子DNA，精子DNA碎片的判斷標(biāo)準(zhǔn)：計數(shù)500個精子，觀察精子光暈大小，根據(jù)光暈與精子頭部橫徑的比例，粗分為大、中、小和無光暈4 個等級，大和中光暈表示精子DNA 完整無碎片，小和無光暈表示精子DNA斷裂為碎片。精子DNA碎片化指數(shù)(DFI)=(小光暈精子+無光暈精子+退化精子)/精子總數(shù)。用實驗室計數(shù)器(血球分類計數(shù)器) 計數(shù)頂體完整和頂體反應(yīng)的數(shù)目，每張圖片精子計數(shù)為200條，計算兩張重復(fù)涂片頂體完整和頂體反應(yīng)所占比率；若兩個百分率之間的差異可接受則報告已發(fā)生頂體反應(yīng)精子的平均百分率，以最接近的整數(shù)報告已發(fā)生頂體反應(yīng)的精子百分率。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。偏態(tài)分布的資料以中位數(shù)及四分位數(shù)[M(P25，P75)]表示，比較采用秩和檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。檢測結(jié)果見表1、表2。

表1　兩組精子密度、活力、形態(tài)正常率比較[M(P25，P75)]

注：與R-ICSI組比較，P<0.05，△P<0.01。

表2　　兩組DFI、頂體完整率及頂體完整率比較[M(P25，P75)]

注：與R-ICSI組比較，P<0.05。

1.3受精率及優(yōu)胚率情況受精后16~20 h在倒置顯微鏡下觀察卵細(xì)胞的原核情況。雙原核(2PN)受精卵定義為正常受精卵，將1PN和多PN的受精卵定義為異常受精卵；受精后培養(yǎng)72 h觀察胚胎情況。參照《現(xiàn)代輔助生育技術(shù)》[1]，根據(jù)卵裂球大小、胞質(zhì)均勻程度、胞漿碎片數(shù)量將受精后3天胚胎分為4級：1級胚胎為卵裂球大小均勻，胞質(zhì)均勻清晰，胞質(zhì)碎片<5%；2級胚胎為卵裂球大小略不均勻，形態(tài)略不規(guī)則，胞質(zhì)碎片<20%；3級胚胎為卵裂球大小不均勻，可有明顯的形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)碎片<50%；4級胚胎為卵裂球大小嚴(yán)重不均勻，胞質(zhì)可有嚴(yán)重顆粒現(xiàn)象，胞質(zhì)碎片>50%；其中1、2級胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。兩組受精率及優(yōu)胚率比較見表3。

表3　兩組受精率及優(yōu)胚率比較±s)

注：與R-ICSI組比較，*P<0.01。

2討論

在我國由于ICSI的治療費用相比IVF要高昂很多，在整個試管嬰兒周期數(shù)中行ICSI的周期數(shù)所占比例并不像歐美等發(fā)達(dá)國家那么高。然而傳統(tǒng)IVF和ICSI之間的選擇仍然存在困難。國內(nèi)外眾多生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在患者病情及基本狀況相同的情況下，IVF-ET與ICSI在受精率、臨床妊娠率及活產(chǎn)率上并無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異[3~6]。但兩者的優(yōu)胚率目前還存在爭議，Van der Westerlaken等[7]的研究結(jié)果提示ICSI獲得的優(yōu)勢胚胎明顯多于IVF-ET，但Kihaile等[8]的研究卻得出相反的結(jié)論。為減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，增加受孕的成功率，根據(jù)男性精液質(zhì)量及功能指標(biāo)選擇助孕方式已成為一種趨勢。但目前選擇時的精液標(biāo)準(zhǔn)尚不統(tǒng)一。

常規(guī)體外受精時受精率低下或完全受精失敗的因素較為復(fù)雜，除卵子因素外精子質(zhì)量是主要因素。精子的密度及其活力是評價精液質(zhì)量的兩項重要指標(biāo)，常用于評價男性的生育能力。顧斌等[9]研究結(jié)果提示，當(dāng)經(jīng)過上游處理法處理后的精子其前向性運動的精子總數(shù)<5×106/mL時，其常規(guī)體外受精率顯著降低。Lu等[10]認(rèn)為精子質(zhì)量異常會降低精卵結(jié)合率及后期的胚胎質(zhì)量；而Tsai等[11]研究結(jié)果卻認(rèn)為ART的治療結(jié)局和子代健康不受精子質(zhì)量的影響，導(dǎo)致上述結(jié)論不一致的原因有可能與其研究對象的納入標(biāo)準(zhǔn)、分組方式以及實驗方法等存在差異有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，IVF-ET組正常受精者精子密度、活率、正常形態(tài)率顯著高于補(bǔ)救ICSI組。提示選擇輔助生殖技術(shù)時精液常規(guī)檢查可預(yù)測IVF-ET或ICSI的助孕結(jié)果，患者在了解兩種輔助生殖技術(shù)的情況下可自己選擇助孕方式。

研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的精液參數(shù)分析結(jié)果不夠精確，使得依靠這一評價的診斷靈敏度降低[12]。Natali等[13]認(rèn)為，僅依據(jù)常規(guī)精液參數(shù)很難確定男性因素是否是導(dǎo)致不孕不育的原因，因此額外的精子功能測試是必要的。近十年來，精子DNA的完整性測定被認(rèn)定為一項重要的精子功能參數(shù)[14]。精子發(fā)生期間，精子DNA出現(xiàn)各種改變，以實現(xiàn)高度的組織、緊致和凝聚態(tài)結(jié)構(gòu)[15]；獨特的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)保護(hù)父親的基因使得其對卵母細(xì)胞傳遞正確的基因組。已有大量的案例研究評估DNA碎片率與人類精液和輔助生殖受精、胚胎發(fā)育和胚胎品質(zhì)及妊娠結(jié)局的關(guān)系[16]。本研究結(jié)果顯示，IVF-ET組正常受精患者洗滌后DFI顯著高于R-ICSI組，且IVF-ET組受精率、優(yōu)胚率顯著高于R-ICSI組。主要原因是行IVF助孕患者的精子密度、活力及精子DNA完整率顯著高于R-ICSI組。

綜上所述，以本研究得出的精液各項指標(biāo)為依據(jù)，當(dāng)精子密度低于11.1×106/mL，正常形態(tài)率低于1.4%，DFI高于15.9%，頂體完整率低于77.3%，頂體反應(yīng)率低于15.7%時建議直接行ICSI助孕，避免IVF受精失敗后行補(bǔ)救ICSI再次失敗，以縮短助孕周期，減輕患者心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

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Guidance of sperm quality in choosing assisted reproductive technology for infertility patients

XIAOXin1,LIDawen,MAGang,CHENGJunping,HEYongzhi

(1NingboUrologyandNephrologyHospital,Ningbo315100,China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate the guidance of sperm quality in choosing assisted reproductive technology for patients with infertility. MethodsWe chose 201 infertile couples receiving conventional in vitro fertilization-embryo transplantation (IVF-ET), in whom, 126 couples (IVF-ET group) succeeded (the number of diodes accounted for≥30% of embryos) and 75 couples (R-ICSI group) with unsuccessful IVF-ET (the number of diodes accounted for <30% of embryos) received remedy intra-cytoplasmic sperm injection (R-ICSI). We compared the semen routine, sperm DNA integrity rate, sperm acrosome intact rate, acrosome reaction rate, rate of fertilization and good embryo rate of the two groups. ResultsThe normal morphology rate, sperm density and living rate of the IVF-ET group were higher than those in the R-ICSI group (all P<0.05). The sperm DNA index (DFI) of the R-ICSI group was significant higher than that of the IVF-ET group (P<0.05). No statistical differences were found in the acrosome intact rate and acrosome reaction rate between the two groups (all P>0.05). The fertilization rate and good embryo rate of the R-ICSI group were lower than those of the IVF-ET group (all P<0.05). ConclusionWhen the sperm density is less than 11.07×106/mL, normal form rate is below 1.4%, DFI is higher than 15.9%, acrosome intact rate is below 77.3% and the acrosome reaction rate is less than 15.7%, we advise to use ICSI to assist reproduction.

Key words:conventional in vitro fertilization-embryo transplantation; remedy intra-cytoplasmic sperm injection; semen quality; fertilization ability

(收稿日期：2015-09-19)

中圖分類號：R312.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)04-0019-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.04.006

通信作者簡介：李大文(1964-)，男，碩士研究生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事生殖男科方面的臨床工作。E-mail： Lidawendavid@aliyun.com

作者簡介：第一肖鑫(1990-)，男，碩士研究生，主要從事泌尿男科方面的臨床工作。E-mail： 835670636@qq.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81360107)；廣西醫(yī)療衛(wèi)生適宜技術(shù)研究與開發(fā)課題(S201421-03)。