LASIK術中瞬時高眼壓對兔視網膜組織NO含量及NOS活性的影響

關文英，趙海霞，王召格，葛瑞春，王瑞芳

(內蒙古醫科大學附屬醫院，呼和浩特010050)

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LASIK術中瞬時高眼壓對兔視網膜組織NO含量及NOS活性的影響

關文英，趙海霞，王召格，葛瑞春，王瑞芳

(內蒙古醫科大學附屬醫院，呼和浩特010050)

摘要：目的觀察準分子激光原位角膜磨鑲術(LASIK)術中不同持續時間的負壓吸引引起的瞬時高眼壓對視網膜組織NO含量及一氧化氮合酶(NOS)活性的影響，探討LASIK術中負壓吸引安全時間。方法將實驗用68只新西蘭大耳白兔隨機分為五組。負壓吸引20 s組(n=20)、負壓吸引45 s組(n=20)和負壓吸引3 min組(n=20)模擬LASIK手術過程，負壓吸引時間分別持續20 s、45 s及3 min；實驗對照組(n=4)僅行單眼原位角膜激光消融，正常對照組(n=4)不進行任何處理。各負壓吸引組分別于術后即刻、7天、10天、14天、28天各處死動物4只，實驗對照組于激光消融后處死動物，同時處死正常對照組動物。采用752型分光光度計測各組視網膜組織NO含量及NOS活性。結果NO含量及NOS活性：實驗對照組與正常對照組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；負壓吸引20 s組、45 s組術后各時點與正常對照組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。負壓吸引3 min組術后即刻與正常對照組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，術后7天、10天高于正常對照組(P均<0.05)，術后14天、28天與正常對照組比較差異無統計學意義(P均>0.05)；術后7天NO含量及NOS活性達高峰，二者表達呈正相關(r=0.982，P<0.05)。結論LASIK術中常規負壓吸引20 s、45 s不會導致視網膜組織NO含量及NOS活性改變；負壓吸引時間延長至3 min可引起視網膜組織NO含量及NOS活性升高，但這種改變是可逆性的，術后修復28天基本恢復正常。

關鍵詞：準分子激光原位角膜磨鑲術；一氧化氮；一氧化氮合成酶；兔

準分子激光原位角膜磨鑲術(LASIK)是目前矯正屈光不正最常用的方法[1]。研究發現，LASIK術中負壓吸引時患者視神經乳頭及網膜視神經節細胞可發生明顯的形態學改變，瞬時髙眼壓可引起視網膜瞬間缺血再灌注損傷，其對視網膜功能的影響與髙眼壓持續時間有關[2,3]。缺血再灌注損傷過程中，NO與一氧化氮合成酶(NOS)在視網膜神經節細胞(RGC)的凋亡中起關鍵作用[4~6]。2009年9月~2010年3月我們觀察了LASIK術中瞬時高眼壓對兔視網膜組織凋亡相關因子NO含量及NOS活性的影響，旨在為屈光不正患者的手術治療提供依據。

1材料與方法

1.1材料健康無眼疾的新西蘭大耳白兔68只，體質量3～4 kg，雌雄不限，均購自內蒙古醫科大學動物實驗中心，室溫環境飼養。負壓發生器(MoriaⅡ負壓發生器，法國Moria公司)；準分子激光治療儀(SVS Apex，德國舒榮公司)。速眠新注射液(軍事醫學科學院軍事獸醫研究所)；地卡因(內蒙古醫學院附屬醫院制劑室)；氯霉素滴眼液(滄州光明藥業有限公司)；涂典必殊眼膏(德國愛爾康公司)。NO試劑盒及NOS試劑盒(南京建成科技有限公司)。

1.2實驗分組與造模將68只兔隨機分正常對照組(n=4)、實驗對照組(n=4)、負壓吸引20 s組(n=20)、負壓吸引45 s組(n=20)、負壓吸引3 min組(n=20)。各負壓吸引組模擬LASIK手術全過程(雙眼為實驗眼)，在LASIK中使用MoriaⅡ負壓發生器，用負壓吸引環置于兔角鞏膜緣制作瞬時高眼壓模型。術前用速眠新注射液0.2~0.4 mL/kg麻醉，術時用0.5%地卡因行表面麻醉后置開瞼器。將負壓發生器置于兔眼角鞏膜緣，監測眼壓，證實瞬時高眼壓(65 mmHg左右)存在。負壓吸引20 s組、負壓吸引45 s組、負壓吸引3 min組負壓吸引分別持續20 s、45 s和3 min，然后角膜微型刀PTK去除角膜上皮(切削直徑6.5 mm，深度50 μm)。角膜基質按照-9.00D進行準分子激光消融(消融直徑6.5 mm，深度127 μm)，激光波長193 nm，能量密度125 mJ/cm2，脈沖頻率10 Hz。實驗對照組僅行單眼原位角膜激光消融，不行負壓吸引。術后實驗對照組及負壓吸引組均滴抗生素眼藥水，涂妥布霉素地塞米松眼膏預防感染。以上操作由同一手術醫師完成。正常對照組取雙眼為實驗眼，不進行任何處理。

1.3視網膜組織NO含量及NOS活性檢測術后即刻正常對照組、實驗對照組均處死動物， 各負壓吸引組分別于術后即刻、術后7天、10天、14天及28天采用空氣栓塞法各處死動物4只。迅速取出眼球，冰鹽水洗去血污，將眼球迅速放在生理鹽水浸濕的無菌紗布上，在超凈工作臺內在上直肌縫線定位，角鞏膜緣處剪去角膜，去除虹膜和晶體，盡可能取凈玻璃體后用眼科顯微鉤鑷迅速分離視網膜，視網膜組織置于EP管中，稱重后直接放入-80 ℃冰箱中保存。檢測時將EP管中視網膜組織研碎，使組織勻漿化并離心，取上清液。采用752型分光光度計各組視網膜組織NO含量及NOS活性：NO含量=(測定管吸光度-空白管吸光度)÷(標準管吸光度-空白管吸光度)×標準品濃度÷標本的蛋白含量；總NOS活性=[(總NOS測定管OD值-空白管OD值)÷呈色物納摩爾消光系數]×(反應液總體積÷取樣量)×[1÷(比色光徑×反應時間)]÷蛋白含量； 蛋白含量=(測定管OD值-空白管OD值)÷(標準管OD值-空白管OD值)×標準管濃度。分析負壓吸引3 min組術后各時點視網膜組織中NO含量與NOS活性的相關性。

2結果

各組視網膜組織NO含量和NOS活性比較見表1。負壓吸引3 min組術后各時點視網膜組織NO含量與NOS活性呈正相關性(r=0.982，P<0.05)。

3討論

準分子激光是一種超紫外線光波，波長193 nm， 產生的熱-聲波能量非常小，傳導到視網膜、玻璃體等眼后段時的光能量極小，不會引起視網膜及視神經損害。 本研究前期證實，激光治療本身對視網膜組織NO含量及NOS活性無明顯影響。 但LASIK中需行鞏膜負壓吸引環吸引角鞏膜緣制作板層角膜瓣，在負壓吸引以及微型角膜刀運行過程中，眼內壓瞬時可達65 mmHg左右，眼壓瞬時升高對眼組織結構和功能的影響一直是臨床關注的問題。

表1　各組視網膜組織NO含量和NOS活性比較±s)

注：與其他組及同組其他時間點比較，*P<0.05，△P<0.01。

Huxtable[7]和Tsai等[8]發現，LASIK后1個月患者的視神經纖維層(RNFL)厚度明顯變薄。Lee等[9]在報道LASIK中負壓為128～141 mmHg，眼內壓最低為65 mmHg，負壓持續時間為45 s，患者分別于術后1天、3天和數天內出現了不同程度的視神經缺血癥狀，伴有視力下降和視野缺損。目前在應用飛秒激光技術矯正屈光不正的手術中，其負壓吸引的時間較長，可能會達到或超過3 min。本課題組前期動物實驗證實，術中負壓吸引造成眼壓的驟升驟降會引起視網膜瞬時缺血再灌注損傷，視網膜結構和功能出現可逆性變化。LASIK負壓吸引導致上述可逆性改變的機制以及負壓吸引的安全時間是目前研究的熱點[10,11]。

NO是一個活躍的化學分子，為內源性短效反應氣體，能溶于組織且能自由地通過細胞膜[12]。NO為重要的細胞內信使，廣泛參與體內多種生理、病理過程。大量的NO可導致毒性自由基產生，進而引起細胞凋亡。關于NO細胞凋亡機制有很多報道，NO引發凋亡的啟動方式在不同生物的細胞中不同，通常情況下NO通過線粒體介導的途徑引起細胞凋亡，線粒體通路是凋亡的主要通路。

研究證實，NOS可催化NO的合成，在組織內將底物L-精氨酸胍基氧化，釋放NO，同時生成L-瓜氨酸[13]。結膜上皮、角膜上皮及內皮，虹膜和睫狀體上皮、虹膜括約肌、睫狀肌、小梁網、鞏膜靜脈竇、集合管內皮、晶狀體內均含有NOS Ⅲ，具有擴張血管、增加血管通透性、調節眼壓等作用；而睫狀體上皮細胞、視網膜、視乳頭等部位含有豐富的NOSⅠ，與眼壓調節、視覺形成與傳導有關；虹膜睫狀體、視網膜、脈絡膜等組織在內毒素和細胞因子的刺激下均能增強NOSⅡ的表達，與各種眼內炎癥，神經元細胞毒性，免疫介導和血流調節等作用有關[14]。

正常細胞和組織可以對體內外環境變化等的持續性刺激作出形態、功能和代謝的反應性調整和適應，若上述刺激超過了細胞和組織的耐受與適應能力，則引起細胞及其間質的物質代謝、組織化學、超微結構乃至光鏡和肉眼可見的異常變化。LASIK中負壓吸引環長時間壓迫眼球，高眼壓長時間持續，可對視神經和視網膜造成瞬時缺血再灌注損傷[15]。視網膜缺血時，組織生成緩激肽、乙酰膽堿、組織胺等物質增多，局部血管內皮細胞在這些刺激因素的作用下生成NOS增多，通過內皮細胞左旋精氨酸-NO通路合成NO。大量NO可能導致毒性自由基形成，造成再灌注損傷。

本研究結果顯示，單純激光治療不會影響視網膜組織中NO含量及NOS活性；負壓吸引20 s組、45 s組視網膜組織NO含量及NOS活力與正常對照組比較差異無統計學意義，表明LASIK術中負壓吸引20~45 s是安全的；負壓吸引3 min組視網膜組織NO含量及NOS活性術后即刻與正常對照組比較差異無統計學意義，術后7天、10天明顯高于正常對照組，術后7天達到高峰，術后14天、28天與正常對照組比較差異無統計學意義，至術后28天基本恢復正常。表明負壓吸引時間延長(3 min)，NO含量及NOS活性明顯升高，但經過一定時間的修復可以恢復，即上述改變是可逆的。

綜上所述，LASIK術中眼壓急劇升高可引起視網膜組織NO含量及NOS活性可逆性增高。且長時間持續的負壓吸引可引起NO含量及NOS活性明顯增高。術中短時間(45 s以下)負壓吸引不影響或僅輕微影響視網膜組織中NO含量及NOS活性。負壓吸引時間延長(3 min)，NO含量及NOS活性明顯升高，但經過一定時間的修復可以恢復，即上述改變是可逆的。盡管LASIK術中瞬時負壓吸引是安全的，但術中仍應盡量使用自動和手動旋轉角膜刀，在保證成功完成角膜瓣制作的同時，縮短負壓吸引的時間，確保手術安全。

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Effects of transient high intraocular pressure during LASIK on NO and NOS activity in retinal tissues

GUANWenying,ZHAOHaixia,WANGZhaoge,GERuichun,WANGRuifang

(TheAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Huhhot010050,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of transient high intraocular pressure (IOP) caused by negative pressure suction at different time of duration during laser-assisted in situ keratomileusis (LASIK) on the changes of NO and NOS in retinal tissues and to investigate the safe time of negative pressure suction during LASIK. MethodsSixteen-eight New Zealand white rabbits were randomly divided into the normal control group (n=4), the experimental control group (n=4), 20 s suction group (n=20), 45 s suction group (n=20) and 3 min suction group (n=20), whose time of negative pressure suction was respectively 20 s, 45 s and 3 min. LASIK surgical procedure was simulated, and the experimental control group only received laser ablation and the normal control group without any treatment. The animals in the suction groups were executed immediately (0 d), after 7 d, 10 d, 14 d and 28 d. The rabbits in the experimental control group were executed after laser ablation. Meanwhile, the rabbits in the normal control group were executed. The NO content and NOS activity in retinal tissue of each group were detected by 752 spectrophotometer. ResultsNO content and NOS activity: no significant difference was found between the normal control group and the experimental control group (all P>0.05), no significant difference was found at every postoperative time between the 20 s suction group, 45 s suction group and normal control group (all P>0.05), no statistically significant difference was found between the 3 min suction group and the normal control group immediately after operation (all P>0.05). Seven days and 10 day after operation, the NO content and NOS activity in the 3 min suction group were higher than those of the normal control group (all P<0.05). No significant difference in the NO content and NOS activity was found between the 3 min suction group and the normal control group 14 days and 28 days after operation (all P>0.05). The NO content and NOS activity reached a peak 7 d after operation, and they were positively correlated with each other (r=0.982， P<0.05). ConclusionsConventional suction of 20 s and 45 s in LASIK does not cause the change of NO content and NOS activity in the retinal tissues. When the suction time extends to 3 min, the NO content and NOS activity, but this change is reversible increase, after 28-day restoration, it can return to normal.

Key words:laser-assisted in situ keratomileusis; nitric oxide; nitric oxide synthetase; rabbit

(收稿日期：2015-11-09)

中圖分類號：R779.63

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)04-0012-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.04.004

通信作者簡介：趙海霞(1968-)，女，博士，主任醫師，教授，主要研究方向為角膜病、青光眼及眼視光學。E-mail: zhaohaixia@sohu.com

作者簡介：第一關文英(1983-)，女，碩士，住院醫師，主要研究方向為眼視光學。E-mail: yingzi830822@126.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(30660194)。