丙戊酸鈉與順鉑聯合應用對人骨肉瘤細胞株U-2 OS增殖、凋亡的影響及其作用機制

閆抗，夏斯龍，王業華

(1徐州醫學院研究生學院，江蘇徐州 221000；2徐州醫學院附屬醫院)

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丙戊酸鈉與順鉑聯合應用對人骨肉瘤細胞株U-2 OS增殖、凋亡的影響及其作用機制

閆抗1，夏斯龍1，王業華2

(1徐州醫學院研究生學院，江蘇徐州 221000；2徐州醫學院附屬醫院)

摘要：目的觀察丙戊酸鈉(VPA)與順鉑(DDP)聯合應用對人骨肉瘤細胞株U-2 OS增殖、凋亡的影響，并探討其可能機制。方法 培養U-2 OS細胞，分為A、B、C、D組，A組加入35 mmol/L VPA+20 mg/L DDP，B組加入35 mmol/L VPA，C組加入20 mg/L DDP，D組未加任何藥物。CCK-8法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡，RT-PCR法檢測細胞凋亡相關基因(Caspase-3、Fas)。結果與D組比較，A、B、C組細胞存活率降低，G0/G1期細胞增加，凋亡率及Fas、Caspase-3相對表達量升高；與C組比較，A組細胞存活率降低，G0/G1期細胞增加，凋亡率及Fas、Caspase-3相對表達量升高；P均<0.05。結論 VPA聯合DDP可抑制U-2 OS細胞增殖，促進其凋亡，且較單用VPA或DDP作用更為明顯；其機制可能與Fas、Caspase-3表達上調有關。

關鍵詞：骨肉瘤；丙戊酸鈉；順鉑

骨肉瘤是青少年常見的惡性骨腫瘤，在小兒骨惡性腫瘤中最多見[1]。順鉑(DDP)是臨床常用的化療藥物，但由于耐藥性及不良反應等因素限制其療效的進一步發揮。丙戊酸鈉(VPA)屬于短鏈脂肪酸家族，是臨床廣泛應用的廣譜抗癲癇藥，屬于組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACi)[2]，具有抑制組蛋白去乙酰化活性的作用。研究[3]表明，VPA在體內外均可通過誘導細胞周期停滯，以促進細胞凋亡和分化，進而抑制多種腫瘤細胞的生長和增殖，其潛在的抗腫瘤作用越來越受到關注。2014年6月～2015年6月，我們觀察了VPA與DDP聯合應用對人骨肉瘤細胞U-2 OS增殖、凋亡的影響，并探討其可能機制，旨在為骨肉瘤的治療藥物選擇提供新的思路。

1材料與方法

1.1細胞株和試劑細胞株：人骨肉瘤細胞株U-2 OS(上海中科學院細胞庫)，用含有10%胎牛血清的1640培養液在37 ℃、5%CO2條件下培養。主要試劑：VPA，DDP，胎牛血清，改良型1640培養基，細胞周期檢測試劑盒，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒，TRIzol試劑盒，Fas，Caspase-3，內參β-actin。

1.2VPA藥物濃度篩選及U-2OS細胞分組、干預 ①VPA藥物濃度篩選實驗：分別用5、10、20、40 mmol/L共4個濃度分別處理細胞24、48 h，計算24 h的藥物半數抑制濃度IC50[4]，并以此濃度作為下述聯合用藥實驗中VPA濃度。②VPA、DDP聯合用藥實驗：設A、B、C、D組，其中VPA濃度為VPA藥物半數抑制濃度IC50，即35 mmol/L，DDP濃度為20 mg/L。

1.3U-2 OS細胞增殖檢測取對數生長期U-2 OS細胞，常規消化，計數，調整細胞密度按5 000/孔，接種于96孔培養板，待細胞生長約70%后加藥。A組加入35 mmol/L VPA+20 mg/L DDP，B組加入35 mmol/L VPA，C組加入20 mg/L DDP，A、B、C組為實驗組；D組未加任何藥物(對照組)。每個濃度設5個平行復孔，處理結束后加入CCK-8，輕搖，37 ℃孵育2 h，采用酶聯免疫檢測儀測定培養24、48 h每孔在450 nm波長處的吸光度(OD)。取5孔OD值的平均值，計算各組細胞的存活率，細胞存活率(%)=(A實驗組/A對照組)×100%。

1.4U-2 OS細胞周期、凋亡檢測取對數生長期U-2 OS細胞常規消化后計數，調整細胞密度按3×105/孔，接種于6孔培養板，待細胞生長約70%后加藥。各組藥物干預同上，藥物作用細胞24 h后用不含EDTA的胰酶消化收集，用PBS洗滌細胞2次。①細胞周期測定：PBS洗滌后，調整細胞濃度為1×106/mL，取1 mL單細胞懸液，離心，去除上清，在細胞中加入體積分數為70%冷乙醇500 μL固定，4 ℃保存，過夜后用PBS洗去固定液；加入100 μL RNase A，37 ℃水浴30 min，再加入400 μL的PI染色混勻，4 ℃避光30 min，上機檢測記錄激發波長488 nm處紅色熒光，記錄G0/G1期細胞數。②細胞凋亡率測定：PBS洗滌后，加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μL的Annexin V-FITC混勻，后加入5 μL的Propidium Iodide，混勻；室溫、避光、反應5～15 min；流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5U-2 OS細胞形態學觀察倒置相差顯微鏡觀察各組細胞經藥物處理24 h后細胞形態學變化。

1.6U-2 OS細胞Fas、Caspase-3檢測細胞處理及分組與“1.4”方法相同，藥物作用24 h后用TRIzol、氯仿、異丙醇等試劑提取各組細胞總RNA，按照TIANScript RT Kit(cDNA第一鏈合成試劑盒)說明書逆轉錄成cDNA，然后按2×Taq Master Mix說明書進行PCR擴增，擴增后的DNA用2%瓊脂糖凝膠進行電泳。采用凝膠成像系統對條帶進行照相，Image J進行灰度值分析。

2結果

2.1各組細胞存活率、G0/G1期細胞、細胞凋亡率比較細胞存活率、G0/G1期細胞、細胞凋亡率比較見表1。

表1　各組細胞存活率、G0/G1期細胞、細胞凋亡率比較

注：與D組比較，*P<0.05；與C組比較，△P<0.05。

2.2各組細胞形態學變化D組U-2 OS細胞增殖良好；B、C組細胞數量減少，部分細胞由梭形變小、變圓，細胞質內顆粒增粗、增多，少量細胞脫落、裂解，可見少量凋亡小體，呈典型凋亡形態改變；A組細胞密度更低，凋亡現象更加明顯。

2.3各組細胞Fas、Caspase-3相對表達量比較細胞Fas、Caspase-3相對表達量比較見表2。

表2　各組細胞Fas、Caspase-3相對表達量比較

注：與D組比較，*P<0.05；與C組比較，△P<0.05。

3討論

骨肉瘤患者預后差，單純手術治愈率僅15%～20%，約50%的患者術后復發。隨著新輔助化療技術的應用，骨肉瘤患者的5年生存率有所提高[5]，但在臨床治療過程中發現其對臨床常用抗腫瘤藥物如鉑類、多柔比星、甲氨蝶呤等逐漸產生耐藥性[6]，甚至是多重耐藥，這對骨肉瘤的治療效果造成極大的影響。

DDP是癌癥化療方案中的重要組分[7]，但細胞耐藥性及不良反應限制其應用，因此設計與DDP的聯合用藥以增強DDP的化療效果成為臨床關注的熱點[8]。有研究表明，HDACi能有效抑制腫瘤細胞增殖，其與多種化療藥物聯用可有效增加抑癌效果。VPA是一種八碳支鏈的脂肪酸鈉鹽，屬于HDACi，作為傳統的抗癲癇藥物，其不良反應輕，患者可長期使用，在抗癲癇治療時表現出很強的組蛋白去乙酰化酶抑制劑活性。已有研究[9～11]表明，VPA對肺癌、淋巴瘤、肝癌等多種腫瘤細胞有抑制作用。然而，VPA聯合DDP是否具有協同抗骨肉瘤作用鮮有報道。本研究顯示，與D組比較，A、B、C組細胞存活率降低，凋亡率升高；與C組比較，A組細胞存活率降低，凋亡率升高。提示VPA聯合DDP可抑制U-2 OS細胞存活，促進其凋亡，VPA聯合DDP具有較強的協同抑癌活性，且較單用VPA或DDP作用更明顯。

細胞凋亡是多種基因調控的結果，Fas基因作為重要的凋亡基因[12]，其表達的蛋白是誘導細胞程序性死亡的信號分子，在正常細胞內可通過信號轉導途徑逐級放大死亡信號，通過相應的受體傳導至細胞核內部，引起核內轉錄基因的改變，從而啟動凋亡程序。近年研究[13]表明，Fas在骨肉瘤中的表達與肺轉移的發生呈負相關，提示通過改變Fas表達可以調整骨肉瘤細胞的侵襲能力。Caspase是由Caspase基因家族轉錄表達的一類具有酶切作用的蛋白質，目前發現有14種，Caspase-3為主要的凋亡執行蛋白[14]，被上游分子激活后能分解細胞的骨架蛋白、細胞器等結構，參與細胞凋亡的具體執行過程。本研究顯示，A、B、C組Fas和Caspase-3相對表達量較D組升高，A組Fas和Caspase-3相對表達量較C組升高，表明VPA聯合DDP可促進Fas、Caspase-3表達，且較單用VPA或DDP作用更為明顯。

總之，VPA聯合DDP可抑制U-2 OS細胞存活，促進其凋亡，且較單用VPA或DDP作用更為明顯；其作用機制可能與Fas、Caspase-3表達上調有關。

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Effect and mechanism of sodium valproate combined with cisplatin on proliferation and apoptosis of human osteosarcoma cell line U-2 OS

YANKang1,XIASilong,WANGYehua

(1GraduateSchoolofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of the sodium valproate (VPA) combined with cisplatin (DDP) on proliferation and apoptosis of human osteosarcoma cell line U-2 OS. MethodsThe osteosarcoma U-2 OS cells were cultured in vitro and were divided into groups A, B, C and D. The groups A, B and C were separately treated with 35 mmol/L VPA+20 mg/L DDP, 35 mmol/L VPA and 20 mg/L DDP, and the group D was not treated. The proliferation was assayed by CCK-8. The cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry (FCM). The gene expression of Fas and Caspase-3 was detected by RT-PCR. ResultsCompared with group D, the cell viabilities of groups A, B and C were decreased, the cells in the G0/G1phase were increased, the apoptosis rate and the expression levels of Fas and Caspase-3 genes were increased; compared with group C, the cell viability of the group A decreased, the cells in the G0/G1phase were increased, the apoptosis rate and the expression levels of Fas and Caspase-3 genes increased. The difference was statistically significant (all P<0.05).Conclusions VPA combined with DDP could inhibit the cell proliferation and induce to apoptosis of human osteosarcoma U-2 OS, and the effect is more obvious than that of using only one of them. The mechanism may be closely related to the up-regulated expression of Fas and Caspase-3.

Key words:osteosarcoma; sodium valproate; cisplatin

(收稿日期:2015-09-23)

作者簡介：第一閆抗(1990-)，男，碩士在讀，主要研究方向為創傷外科。E-mail: xzmcyankang@163.com

中圖分類號：R738.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)03-0011-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.004

通信作者簡介：王業華(1966-)，男，博士，主任醫師，主要研究方向為創傷外科。E-mail: 736283162@qq.com