高效液相色譜法同時測定土貝母中土貝母苷甲、乙和丙的含量*

黃 瑾，張 杰，顧正兵

（1．上海市浦東新區人民醫院藥劑科，上海 201299； 2．江蘇永健醫藥科技有限公司，江蘇 泰州 225300）

高效液相色譜法同時測定土貝母中土貝母苷甲、乙和丙的含量*

黃 瑾1，張 杰2，顧正兵2

（1．上海市浦東新區人民醫院藥劑科，上海 201299； 2．江蘇永健醫藥科技有限公司，江蘇 泰州 225300）

目的 建立同時測定土貝母中土貝母苷甲、土貝母苷乙和土貝母苷丙3種皂苷類成分含量的高效液相色譜(HPLC)法。方法 色譜柱采用Kromasil C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm），流動相為乙腈－水(31∶69)，流速為1．0 mL／min，柱溫為30℃，檢測波長為214 nm。結果 土貝母苷甲、乙、丙進樣量分別在1．28～12．8 μg，0．241～2．41 μg，0．515～5．15 μg范圍內與峰面積線性關系良好，平均加樣回收率分別為99．10%，98．95%和98．78%，RSD分別為0．43%，0．62%，0．46%(n＝6)。結論 該法簡便、準確，可為土貝母的質量評價提供參考。

土貝母；高效液相色譜法；土貝母苷甲；土貝母苷乙；土貝母苷丙

土貝母為葫蘆科植物土貝母 Bolbostemma panicula- tum(Maxim．)Franquet的干燥塊莖，具有解毒、散結、消腫的功效，主治乳癰、瘰疬、痰核[1]。土貝母中的皂苷類成分具有顯著的抗腫瘤及抗促瘤活性，其皂苷類代表性成分為土貝母苷甲、土貝母苷乙和土貝母苷丙，且土貝母苷乙和丙抗腫瘤活性強于土貝母苷甲，毒性均低于苷甲[2－10]。2010年版《中國藥典(一部)》僅以土貝母苷甲為指標性成分，不能全面控制此藥材的質量。目前，國內外關于土貝母含量測定的文獻報道較少，且均為單一測定了土貝母苷甲的含量[11－13]。本試驗中建立了同時測定土貝母中土貝母苷甲、土貝母苷乙和土貝母苷丙含量的高效液相色譜(HPLC)法，可為土貝母藥材的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Waters－1525型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Sartorius CP225D十萬分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；KQ 2200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。對照品土貝母苷甲、土貝母苷乙和土貝母苷丙均從土貝母中經制備液相分離純化得到，經過MS，1H－NMR，13C－MNR鑒定化合物結構，通過HPLC測定，用面積歸一化法計算純度均大于 98%。乙腈（色譜純，上海藍世生化技術有限公司），水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。土貝母藥材來源于全國各地，經嘉興學院醫學院王峻副教授鑒定為正品。

2 方法與結果

2．1 溶液制備

取不同來源的樣品粉末（過4號篩）約1．0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱重，用70%乙醇補足失重，搖勻，濾過，取續濾液，用微孔濾膜（0．45 μm）濾過，即得供試品溶液。精密稱取對照品土貝母苷甲、土貝母苷乙和土貝母苷丙適量，分別用甲醇制成土貝母苷甲、乙、丙質量濃度為1．941，0．604 1，0．736 3 g／L的單一對照品貯備液。精密量取上述3個對照品貯備液適量，用甲醇稀釋，制成每1 mL分別含土貝母苷甲、土貝母苷乙、土貝母苷丙0．640 2，0．120 8，0．257 6 mg的混合對照品溶液。

2．2 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相：乙腈－水（31∶69）；流速：1．0 mL／min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL；檢測波長：214 nm。在此條件下，對照品及供試品溶液色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2．3 方法學考察

線性關系考察：精密吸取混合對照品溶液2，5，10，15，20 μL，注入高效液相色譜儀，測定。以峰面積值（Y）對進樣量（X）作線性回歸，得土貝母苷甲的回歸方程為 Y＝118 640X－56 002（R2＝0．999 3），線性范圍為1．28～12．8μg；土貝母苷乙的回歸方程為 Y＝105700X－12 908（R2＝0．999 5），線性范圍為0．241～2．41 μg；土貝母苷丙的回歸方程為 Y＝92 380 X－20 936（R2＝0．998 7），線性范圍為0．515～5．15 μg。

精密度試驗：取同一混合對照品溶液，連續進樣6次。結果土貝母苷甲、土貝母苷乙、土貝母苷丙峰面積的RSD分別為0．73%，1．2%，1．0%(n＝6)，表明儀器的精密度良好。

重復性試驗：取同一批土貝母藥材 6份，按 2．1項下方法制備供試品溶液，進樣分析。土貝母苷甲、土貝母苷乙和土貝母苷丙含量的測定，結果的 RSD分別為 1．1%，1．7%，1．4%(n＝6)，表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，4，8，12，24 h時進行HPLC測定，每次進樣10 μL，記錄峰面積。結果土貝母苷甲、土貝母苷乙和土貝母苷丙峰面積的 RSD分別為1．2%，2．3%，1．6%(n＝5)，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取同一批已知含量的樣品6份，每份約0．5 g，精密稱定，分別準確加入一定量的對照品貯備液，按2．1項下方法制備供試品溶液，進樣測定含量，計算回收率，結果見表1。

表1 3種皂苷類成分加樣回收試驗結果（n＝6）

2．4 樣品含量測定

取不同來源的干燥土貝母粉末約1．0 g，精密稱定。按2．1項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算不同來源的土貝母藥材中土貝母苷甲、土貝母苷乙、土貝母苷丙含量。結果見表2。

表2 不同來源土貝母藥材中各成分含量測定結果(mg／g，n＝3)

3 討論

本試驗中比較了甲醇－水、乙腈－水兩個流動相系統，由于土貝母苷乙和土貝母苷丙結構相近，極性差異小，甲醇－水系統不能使3個成分很好地分離，其次甲醇在確定的檢測波長（214 nm）下末端吸收較大，從而確定選擇乙腈－水系統。曾比較過等度洗脫以及梯度洗脫，發現以乙腈－水（31∶69）為流動相等度洗脫，各成分均能達到基線分離，且分析時間較短。此外，利用DAD檢測器對200～400 nm波長范圍內的色譜峰進行對比，綜合考慮基線、色譜峰峰形及響應值、干擾成分，最終確定檢測波長為214 nm。

樣品提取時，以土貝母苷甲、土貝母苷乙和土貝母苷丙為評價指標，考察了超聲、回流2種提取方式及甲醇、乙醇2種提取溶劑，綜合考慮，確定用乙醇超聲提取。用單因素考察乙醇濃度、提取體積和提取時間，確定最佳工藝為70%乙醇、25 mL、超聲提取0．5 h。此供試品溶液制備方法，與2010版《中國藥典》相應的方法比較，用70%乙醇經超聲提取，過濾后直接進樣分析，操作簡便、經濟環保且分離效果好。

由表2可知，土貝母藥材中土貝母苷甲含量＞土貝母苷丙含量＞土貝母苷乙含量，4個不同來源的土貝母藥材中各成分含量差異較小，其中山西產土貝母含量相對略高。本試驗中首次建立了用HPLC法同時測定土貝母藥材中土貝母苷甲、土貝母苷乙和土貝母苷丙含量的方法，操作簡單可行、結果準確，為土貝母的質量控制提供參考依據。

[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)[M]．北京：中國醫藥科技出版社，2010：18－19．

[2]鄔 科，盧立瓊 ．浙貝母和土貝母的鑒別[J]．中國藥業，2010，19(10):75．

[3]石會麗，韓燕萍，肖會玲．土貝母藥理作用研究進展[J]．陜西中醫，2004，5(9):857．

[4]傅章才，周蘭英，孔凡華，等．土貝母化學成分研究(Ⅰ)[J]．中草藥，1987，18(4):6．

[5]孔凡華，朱大元，徐任生，等．土貝母化學成分的研究(Ⅲ)土貝母甙甲的結構[J]．化學學報，1988，46(8):772．

[6]孔凡華，朱大元，徐任生，等．土貝母化學成分的研究(Ⅳ)土貝母甙乙、丙、丁的結構[J]．化學學報，1988，46(4):409．

[7]何鳳興，張照榮，李凌軍，等．土貝母脂溶性成分的研究[J]．齊魯中醫藥情報，1991，26(4):3－4．

[8]馬潤娣，于立堅，王永清，等．土貝母苷甲抗腫瘤活性的研究[J]．中國腫瘤臨床，1994，21(6):446．

[9]馬潤娣，于立堅，王永清，等．土貝母皂苷甲素對鼠耳炎性水腫和小鼠皮膚促癌過程的強抑制作用[J]．科學通報，1991(18): 1 421．

[10]李曉晶，姜琳琳，吳智南，等．土貝母的 HPLC指紋圖譜研究[J]．中草藥，2007，38(6):927．

[11]魏有良，楊小梅，徐長根，等．HPLC法測定土貝母中土貝母苷甲含量[J]．西北藥學雜志，2000，15(3):107－108．

[12]金 良，唐俊琪．HPLC法測定土貝消腫湯中熊果酸和土貝母苷甲的含量[J]．陜西中醫學院學報，2010，33(3):87－88．

[13]崔翰明，程慧平，朱曉蕓．HPLC法測定甲腫消及大鼠血清中土貝母苷甲的含量[J]．中國中醫藥信息雜志，2008，15(11): 37－38．

Determination of TubeimosideⅠ,TubeimosideⅡand TubeimosideⅢ in Bolbostemma paniculatum(Maxim．)Franquet by HPLC

Huang Jin1,Zhang Jie2,Gu Zhengbing2

(1．Department of Pharmacy,Shanghai Pudong New Area People′s Hospital,Shanghai,China 201299; 2．Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Technology CO．,LTD．,Taizhou,Jiangsu,China 225300)

Objective To develop an HPLC method for content determination of tubeimosideⅠ,t－ubeimosideⅡand tubeimosideⅢ in Bolbostemmapaniculatum(Maxim．)Franquet．Methods The determination was carried out on a C18column(250 mm×4．6 mm,5 μm) eluted with acetonitrile and water．The flow rate was 1．0 mL／min,and the detected wavelength was set 214 nm．Results The peak areas and the sample quantity of the three components had good linear relationship in the range of 1．28～12．8 μg for tubeimosideⅠ, 0．241～2．41 μg for tubeimosideⅡ and 0．515～5．15 μg for tubeimosideⅢ．The average recoveries were 99．10%,98．95% and 98．87%,respectively．Conclusion The method was proved to be simple,accurate and provided reference for comprehensive quality control of Bolbostemma paniculatum(Maxim．)Franquet．

Bolbostemma paniculatum(Maxim．)Franquet;HPLC;tubeimosideⅠ;tubeimosideⅡ;tubeimosideⅢ

R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)01－0058－03

黃瑾，博士研究生，主要從事藥品檢驗工作，(電話)021－58921995(電子信箱)john70550＠163．com；顧正兵，博士研究生，主要從事藥品檢驗工作，本文通訊作者，(電話)0523－80183620(電子信箱) zbg＠youging．com。

2015－07－28；

2015－09－22)

*上海市浦東新區衛生局面上項目，項目編號：PW2013A－12。