傷科消腫顆粒處方提取工藝優(yōu)選*

李海英，劉 武，劉吉成

（1．廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023； 2．廣西壯族自治區(qū)玉林食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 玉林 537000）

傷科消腫顆粒處方提取工藝優(yōu)選*

李海英1，劉 武1，劉吉成2

（1．廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023； 2．廣西壯族自治區(qū)玉林食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 玉林 537000）

目的 優(yōu)選傷科消腫顆粒的提取工藝條件。方法 以揮發(fā)油的提取量、干膏量、芍藥苷和綠原酸含量為綜合指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳提取條件。結(jié)果 先取薄荷用水提取，揮發(fā)油提取率為75．3%；再取薄荷藥渣及藥液與其他14味藥材，加水煎煮2次，芍藥苷和綠原酸提取率為79．8%和83．3%；干膏量為每張?zhí)幏?6．49 g；濃縮水提液至相對(duì)密度1．15，加乙醇至60%（g／g），冷藏靜置12 h，減壓濃縮上清液，芍藥苷和綠原酸的轉(zhuǎn)移保留率為80%和74%，干膏量為每張?zhí)幏?0．01 g。結(jié)論 優(yōu)選的提取工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可行，為傷科消腫顆粒處方提取工藝條件提供了科學(xué)依據(jù)。

傷科消腫顆粒；正交試驗(yàn)；提取工藝

傷科消腫顆粒是在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科多年臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)處方基礎(chǔ)上生產(chǎn)的顆粒劑型醫(yī)院制劑，主要由土鱉蟲(chóng)、赤芍、澤蘭、金銀花、粉防己、連翹等15味中藥材經(jīng)提取加工等步驟制成，具有活血止痛、利水消腫之功效[1－2]，臨床主要用于外傷或車(chē)禍患者骨折術(shù)。中藥顆粒劑給藥方便，既可吞服又可混懸或溶解在水中服用，且吸收好、起效快、不良反應(yīng)小、攜帶方便[3]。本試驗(yàn)中是在臨床應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)處方基礎(chǔ)上[1－2]，對(duì)方中有效成分進(jìn)行提取、純化而制成醫(yī)院制劑，以在療效、成本、不良反應(yīng)、患者服藥順應(yīng)性等諸多方面綜合衡量，對(duì)此方進(jìn)一步優(yōu)化成顆粒劑，研制新的中成藥制劑，為更好地發(fā)揮傷科消腫顆粒療效提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜議（美國(guó)安捷倫科技有限公司，配DAD檢測(cè)器）；Millipore Simplicity－UV型超純水機(jī)(美國(guó)密里博公司)；SB2200－T型超聲波清洗器（上海必能信公司）；BZF－30型電熱真空干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)）；RE－52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；BT224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；MA100型水分測(cè)定儀（中國(guó)賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；CP225D1／10萬(wàn)電子天平（中國(guó)賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；GM－0．33Ⅱ隔膜真空泵（天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SHB－Ⅱ循環(huán)式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)易有限公司）；OS101－2AB型電熱干燥箱（重慶銀河試驗(yàn)儀器有限公司）。乙醇（分析純）、乙腈（色譜純）、磷酸（分析純），均購(gòu)自西隴化工股份有限公司；淀粉、糊精、蔗糖、乳糖為輔料。芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)為 110736－201337，含量94．9%），綠原酸對(duì)照品（批號(hào)為110753～201314，含量96．6%），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。試驗(yàn)所用各藥材購(gòu)于廣西玉林中藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣西玉林食品藥品檢驗(yàn)所中藥室劉吉成鑒定為正品，詳見(jiàn)表1。

表1 傷科消腫顆粒中15味中藥材一覽表

2 方法與結(jié)果

2．1 指標(biāo)成分的測(cè)定

傷科消腫顆粒方中薄荷需單獨(dú)提取，故以揮發(fā)油收集量作為薄荷提取的考察指標(biāo)；赤芍和金銀花中的主要有效成分別為芍藥苷和綠原酸[4]，與本方的功能主治有一定相關(guān)性，故將芍藥苷和綠原酸作為傷科消腫顆粒提取工藝篩選時(shí)含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。為更有效地提取傷科消腫顆粒中的成分，另將與本方中藥材提取得到的干膏量作為工藝篩選指標(biāo)。各指標(biāo)成分檢測(cè)方法為芍藥苷和綠原酸，用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)量，波長(zhǎng)分別為230 nm和327 nm；揮發(fā)油和干膏用重量法測(cè)量。

2．2 含量測(cè)定方法學(xué)考察

色譜條件：色譜柱為菲羅門(mén)Gemini C18柱(250 mm× 4．6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈－0．1%磷酸溶液（14∶86）；流速為1．0 mL／min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)芍藥苷為230 nm，綠原酸為327 nm；進(jìn)樣量為10 μL。在此條件下，理論板數(shù)以芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。芍藥苷在進(jìn)樣溶液質(zhì)量濃度為2．754～275．4 μg／mL時(shí)，與峰面積線(xiàn)性關(guān)系為 Y＝10．93 X＋7．795（r＝0．999 4），平均回收率為98．3%，RSD為1．4%；綠原酸進(jìn)樣溶液質(zhì)量濃度為4．343～434．3 μg／mL時(shí)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系為 Y＝20．55 X－5．15（r＝0．999 6），平均回收率為111．4%，RSD為2．6%。

2．3 提取工藝正交試驗(yàn)

2．3．1 揮發(fā)油提取預(yù)試驗(yàn)

處方中薄荷的揮發(fā)油為藥理活性成分之一，屬輕質(zhì)油。稱(chēng)取薄荷100 g，加入藥材8倍量水，浸泡20 min，水蒸氣蒸餾至揮發(fā)油的量不再增加，記錄各時(shí)間點(diǎn)揮發(fā)油的收集量。結(jié)果提取0．5，1，1．5，2，2．5，3 h時(shí)揮發(fā)油收集量分別為0．3，0．5，0．67，0．75，0．76，0．76 mL，結(jié)果表明，在2．5 h以后油收集量變化不大，故選擇1．5，2，2．5 h為考察提取時(shí)間的3個(gè)水平。

2．3．2 揮發(fā)油提取正交試驗(yàn)優(yōu)選

浸泡時(shí)間：稱(chēng)取薄荷藥材3份每份100 g，分別加水浸泡20，30，40 min，用水蒸氣蒸餾，測(cè)量揮發(fā)油的收集量。

加水量：稱(chēng)取薄荷藥材3份，每份100 g，分別加6，8，10倍水浸泡，用水蒸氣蒸餾，測(cè)量揮發(fā)油的收集量。

以浸泡時(shí)間（A）、加水量（B）、煎煮時(shí)間（C）作為揮發(fā)油提取正交試驗(yàn)的考察因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平。采用 L9（34）正交試驗(yàn)法進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)選揮發(fā)油的最佳提取工藝。正交試驗(yàn)水平因素見(jiàn)表2。

2．3．3 水提工藝正交試驗(yàn)優(yōu)選

提取時(shí)間：取薄荷藥渣及藥液與土鱉蟲(chóng)、赤芍、金銀花、益母草等其他14味藥材3份煎煮提取，分別提取2，3，4 h，濾過(guò)，以干膏重、芍藥苷含量、綠原酸含量綜合評(píng)價(jià)分析作為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳水提取工藝。

表2 揮發(fā)油提取因素水平表

提取次數(shù)：取薄荷藥渣及藥液與土鱉蟲(chóng)、赤芍、金銀花、益母草等其他14味藥材3份煎煮提取，分別提取1，2，3次，濾過(guò)，以干膏重、芍藥苷含量、綠原酸含量綜合評(píng)價(jià)分析作為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳水提取工藝。

加水量：取薄荷藥渣及藥液與土鱉蟲(chóng)、赤芍、金銀花、益母草等其他14味藥材3份煎煮提取，分別加6，8，10倍水，濾過(guò)，以干膏量、芍藥苷含量、綠原酸含量綜合評(píng)價(jià)分析作為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳水提取工藝。

本方臨床使用均為水提取，根據(jù)一般水提取以提取時(shí)間（A）、提取次數(shù)（B）、加水量（C）作為考察因素，本方輕質(zhì)和重質(zhì)藥材各半，吸水率較大的藥材粉防己、茯苓等占20%左右，故選擇加水量6，8，10倍。每個(gè)因素取3個(gè)水平，采用 L9（34）正交試驗(yàn)法安排試驗(yàn)，以干膏重、芍藥苷含量、綠原酸含量綜合評(píng)價(jià)分析作為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳水提取工藝。正交試驗(yàn)水平因素表見(jiàn)表3。

表3 水提試驗(yàn)因素水平表

2．3．4 醇沉工藝正交試驗(yàn)

相對(duì)密度：取水提液分別濃縮相對(duì)密度至1．10，1．15，1．20，再用一定濃度的乙醇醇沉，靜置一定時(shí)間后以固體減少率、芍藥苷和綠原酸的含量綜合評(píng)價(jià)分析作為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳醇沉工藝。

醇沉濃度：分別取濃縮至一定密度的提取液3份，再分別用50%，60%，70%乙醇醇沉，靜置一定時(shí)間后以固體減少率、芍藥苷和綠原酸的含量綜合評(píng)價(jià)分析作為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳醇沉工藝。

醇沉濃度：分別取濃縮至一定密度的提取液3份，再用一定濃度的乙醇醇沉，分別靜置12，24，48 h后以固體減少率、芍藥苷和綠原酸的含量綜合評(píng)價(jià)分析作為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳醇沉工藝。

水提時(shí)藥材所含鞣制、淀粉等無(wú)效成分溶出，為了進(jìn)一步去除無(wú)效成分，改善制劑狀況減少服用量，保證制劑的溶化性，加入一定量乙醇，使提取液達(dá)到適當(dāng)乙醇濃度來(lái)除去雜質(zhì)，對(duì)醇沉的工藝條件進(jìn)行篩選，考察濃縮相對(duì)密度（A）、醇沉濃度（B）、醇沉?xí)r間（C）因素。濃縮液1．05時(shí)過(guò)稀量大，不利于沉淀出無(wú)效成分且需要大量乙醇增加生產(chǎn)成本，濃縮液1．25時(shí)過(guò)稠且加入乙醇后總體積小，沉淀易被濃縮液包裹，不易過(guò)濾造成濃縮液殘留在沉淀物中，故濃縮液相對(duì)密度考察選擇1．10，1．15，1．20。醇沉濃度也是根據(jù)一般制備顆粒劑的醇沉濃度50%～70%，故選取50%，60%，70%濃度的乙醇醇沉。每個(gè)因素取3個(gè)水平，采用 L9（34）正交試驗(yàn)法安排進(jìn)行試驗(yàn)，以固體減少率、芍藥苷和綠原酸的含量綜合評(píng)價(jià)分析作為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳醇沉工藝。正交試驗(yàn)水平因素表見(jiàn)表4。

表4 醇沉試驗(yàn)因素表

2．4 供試品溶液的制備與測(cè)定

揮發(fā)油樣品的制備及測(cè)定：稱(chēng)取100 g薄荷藥材9份，分別置揮發(fā)油提取器中，按各揮發(fā)油提取工藝制備，分別記錄各工藝的揮發(fā)油收集量。

水提取樣品的制備及測(cè)定：稱(chēng)取9份單個(gè)處方量的薄荷藥材備用，將薄荷按揮發(fā)油項(xiàng)下提取揮發(fā)油后，藥渣及藥液與其他土鱉蟲(chóng)、赤芍、金銀花、益母草等其他14味藥材合并，按水提工藝制備，得到提取液濃縮，干燥記錄干膏重，然后取干膏約0．5 g，精密稱(chēng)定，置25 mL容量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，過(guò)濾，取續(xù)濾液用0．45 μm微孔濾膜過(guò)濾。精密吸取供試品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定并采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算芍藥苷和綠原酸的含量。

醇提取樣品的制備及測(cè)定：取已得到的濃縮液，按各醇沉工藝制備，得到醇沉液濃縮，干燥記錄干膏重，然后取干膏約0．5 g，精密稱(chēng)定，置25 mL容量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，過(guò)濾，取續(xù)濾液用0．45 μm微孔濾膜過(guò)濾。精密吸取供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定并采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算芍藥苷和綠原酸的提取率。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5至表10。

以揮發(fā)油得量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)上述揮發(fā)油提取正交試驗(yàn)及方差分析，結(jié)果表明，浸泡時(shí)間（因素A）無(wú)差異 FA＜F1－0．10（2，2），從生產(chǎn)周期方面考慮，選 A1，即浸泡時(shí)間為20 min；加水量（因素B）有差異，F(xiàn)1－0．10（2，2）＜FB＜F1－0．05（2，2），應(yīng)選B3水平，但從極差上看，B2和B3接近，故選B2，即加8倍量水；提取時(shí)間（因素C），有顯著性差異 F1－0．05（2，2）＜FC＜F1－0．01（2，2），應(yīng)選 C3即提取2．5 h，最優(yōu)組合確定為A1B2C3，即加入8倍量水，浸泡20 min，水蒸汽蒸餾保持微沸提取2．5 h。

通過(guò)考察干膏得量、芍藥苷、綠原酸3個(gè)指標(biāo)，權(quán)重法計(jì)算所得綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果表明，提取時(shí)間（因素A）無(wú)差異 FA＜F1－0．10（2，2），從直觀結(jié)果和生產(chǎn)周期方面考慮，選 A1，即提取時(shí)間為 2 h；提取次數(shù)（因素 B）有差異 F1－0．10（2，2）＜FB＜F1－0．05（2，2），應(yīng)選 B3水平，但從極差上看，B2和 B3接近，故選B2，即提取2次；加水量（因素C），有顯著性差異 F1－0．05（2，2）＜FC＜F1－0．01（2，2），應(yīng)選 C3，即加水量為10倍量，最優(yōu)組合確定為A1B2C3，即加10倍量水煎煮2次，每次2 h。

表5 揮發(fā)油提取工藝正交設(shè)計(jì)及指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

表6 揮發(fā)油提取工藝正交試驗(yàn)方差分析表

表8 綜合評(píng)分的方差分析

表9 醇沉工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

表10 綜合評(píng)分的方差分析

通過(guò)考察固體減少率、芍藥苷、綠原酸3個(gè)指標(biāo)，權(quán)重法計(jì)算所得綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果表明，濃縮相對(duì)密度（因素A）有差異 F1－0．10（2，2）＜FA＜F1－0．05（2，2），應(yīng)選A1水平，考慮相對(duì)密度A1清膏量大醇沉需使用較大量的乙醇，后續(xù)濃縮耗能也大，從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)權(quán)衡利弊選擇A2，即濃縮相對(duì)密度為1．15；醇沉濃度（因素B），有顯著性差異 F1－0．05（2，2）＜FB＜F1－0．01（2，2），從直觀結(jié)果上分析，B1和B2很接近，結(jié)合生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，醇沉濃度60%的澄清度會(huì)明顯比50%的好，故選擇B2，即醇沉濃度為60%；靜置時(shí)間（因素C）無(wú)差異 FC＜F1－0．10（2，2），從直觀結(jié)果和生產(chǎn)周期成本考慮，選 C1，即靜置時(shí)間為 12 h。理論上最優(yōu)組合為A1B1C1，結(jié)合實(shí)際考慮確定最優(yōu)組合A2B2C。即取濃縮至約1．15（80℃）的清膏，加乙醇使含醇量為60%（g／g），順同一方向充分?jǐn)嚢韬罄洳仂o置12 h。

2．5 優(yōu)選工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

按上述確定的最佳揮發(fā)油、水提、醇沉試驗(yàn)條件分別平行提取3份，計(jì)算得到揮發(fā)油提取率為75．3%，RSD為0．77%(n＝3)，水提取的芍藥苷、綠原酸提取率為79．8%，83．3%，干膏量為每張?zhí)幏?6．49 g，RSD分別為3．71%，2．90%，1．16%(n＝3)，醇沉后的芍藥苷轉(zhuǎn)移保留率為80%，綠原酸轉(zhuǎn)移保留率為74%，固體減少率為43．37%，干膏量為每張?zhí)幏?0．01 g，RSD分別為1．95%，3．16%，1．93%，1．76%(n＝3)，表明該工藝合理、穩(wěn)定、可行。

3 討論

在劑型選擇方面，參照文獻(xiàn)可選擇注射劑、膠囊、膏藥、酊劑等劑型，但考慮到中藥注射劑輸液反應(yīng)多[5－6]，生物制劑藥物研發(fā)的新興領(lǐng)域，研發(fā)周期長(zhǎng)、失敗率較高[7]。因毒膠囊猖獗市場(chǎng)，貼劑、酊劑等存在刺激性大、吸收慢且污染衣物等缺點(diǎn)，最終選擇可吞服又可混懸或溶解在水中服用、吸收好、起效快、不良反應(yīng)小、攜帶方便的顆粒劑。薄荷揮發(fā)油提取時(shí)蒸餾要控制微沸狀態(tài)，否則沸騰過(guò)猛形成的油珠不易聚集，且部分揮發(fā)油可能會(huì)逸出，影響讀數(shù)的準(zhǔn)確性，故在提取時(shí)需控制蒸餾溫度。根據(jù)原方湯劑采用水提可以提取出有效藥效成分，由于水提后干膏得量約每張?zhí)幏?6．5 g，若直接干燥制粒則單方服用量太大，考慮方中金銀花、澤蘭、茯苓、粉防己等藥材所含淀粉等無(wú)效成分溶出，為了進(jìn)一步去除無(wú)效成分，改善制劑狀況減少服用量，保證制劑的溶化性進(jìn)行醇沉除雜，在醇沉工藝研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，乙醇應(yīng)邊攪拌邊緩緩加入，否則提取液局部濃度過(guò)高，會(huì)快速出現(xiàn)蓬松的絮狀沉淀并包裹部分提取液，給過(guò)濾帶來(lái)困難，并影響醇沉效果。處方中藥物提取的干膏量越多表明提取效率越好，在醇沉中干膏量越少表明提取醇沉出的雜質(zhì)越多。

[1]劉 武，米 琨，王 斌，等．活血利水法治療四肢骨折術(shù)后腫脹療效觀察[J]．新中醫(yī)雜志，2011，43(9):59．

[2]劉 武，米 琨，伏春華，等．活血利水法治療骨折術(shù)后肢體腫脹 320例的臨床回顧性研究[J]．廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，14(3):18．

[3]陶 晶．淺談中草藥制成顆粒劑的優(yōu)點(diǎn)[J]．中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2009，3(17):183．

[4]陸小華，馬 驍，王 建，等．赤芍的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J]．中草藥，2015，46（4）:595－596．

[5]丁 紅，趙俊蘋(píng)．淺談中藥注射劑的不良反應(yīng)發(fā)生原因[J]．醫(yī)藥與保健，2014，17（1）:128－129．

[6]陳婉玲，李宇清，楊肖敏，等．49例中藥注射劑輸液反應(yīng)原因分析及應(yīng)對(duì)策略[J]．中華全科醫(yī)學(xué)，2010，8（2）:204－205．

[7]田 軍，郝博濟(jì)．抗高血壓藥物靶標(biāo)及劑型的研發(fā)進(jìn)展[J]．中國(guó)藥房，2013，24(9):852－855．

Optimization Study on Extracting Technology of Shangkexiaozhong Granules

Li Haiying1,Liu Wu1,Liu Jicheng2

(1．First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning,Guangxi,China 530023; 2．Guangxi YuLin Institute for Food and Drug Control,Yulin,Guangxi,China 537000)

Objective To optimize the extracting technology conditions of shangkexiaozhong Granules．M ethods Orthogonal design was used to optimize the extraction conditions,with the content of multi－target ingredients such as the extraction of volatile oil,total solid, content of paeoniflorin and chlorogenic acid as comprehensive evaluation indexes．Results The optimum extraction conditions were as follows:take a certain amount of mint extract with water;the volatile oil content was 75．3% by this way;take the mint medical and the other 14 medicinal materials extracted with water for 2 times,the extraction percentage of Paeoniflorin and chlorogenic acid were 79．8% and 83．3%;the quantity of dry paste was 16．49 g per formula;then concentrated water－decocted liquid to be 1．15 on relative density;added ethanol to 60% (g／g);then kept them to be in cold storage and standing by 12 h;reduced pressure and concentrated the supernatant,with the rate of transfer－remaining were 80% and 74%,and the quantity of dry paste was 10．01 g per formula．Conclusion The Optimization of extraction process is simple,stable and feasible．The results provide the scientific experimental basis for determining the technology conditions of Shangkexiaozhong Granules．

Shangkexiaozhong Granules;Orthogonal Test;extracting process

TQ461；R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)01－0013－05

李海英（1979－），女，漢族，主管藥師，主要從事藥理學(xué)研究，（電子信箱）841733449＠qq．com；劉武（1964－），男，漢族，博士研究生，教授，主要從事中醫(yī)骨傷臨床研究，本文通訊作者，（電子信箱）dawu6465＠126．com。

2015－07－28)

*2013年廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中壯瑤藥制劑研發(fā)類(lèi)課題，項(xiàng)目編號(hào)：GZZJ13－07。