基于螺旋型鉑銥合金電極的植入式葡萄糖生物傳感器*

余江淵，朱志剛，陳　誠，李嶄虹，陳云霞（.上海第二工業大學工學部環境與材料工程學院，上海20209；2.景德鎮陶瓷學院材料科學與工程學院，江西景德鎮33300）

?

基于螺旋型鉑銥合金電極的植入式葡萄糖生物傳感器*

余江淵1，2，朱志剛1*，陳誠1，李嶄虹1，陳云霞2*
（1.上海第二工業大學工學部環境與材料工程學院，上海201209；2.景德鎮陶瓷學院材料科學與工程學院，江西景德鎮333001）

摘要：采用螺旋型鉑銥合金電極設計，旨在提高植入式葡萄糖生物傳感器的葡萄糖氧化酶擔載量并增大工作電極的電化學活性面積。以掃描電鏡（SEM）觀察聚氨酯（Polyurethane，PU）半透膜的形貌，采用循環伏安法（CV）和計時電流法（I-T）考察PU涂覆厚度、PU含量以及酶含量等參數對傳感器電化學性能的影響，結果表明：所制備的螺旋型傳感器靈敏度在20 nA/(mmol/L)~ 30 nA/(mmol/L)，可在人體生理條件范圍內線性檢測（2 mmol/L~30 mmol/L）葡萄糖濃度，并且具有良好的重現性、穩定性和選擇性，符合電極長期植入式需求，有望作為今后糖尿病患者血糖連續監測的關鍵器件。

關鍵詞：葡萄糖生物傳感器；螺旋線圈電極；聚氨酯半透膜；選擇性

中國糖尿病患者有逐年上升的趨勢，其中I型糖尿病患者總數在700萬~1 000萬之間，占到中國糖尿病患者總數的10%［1］。在全世界范圍內，糖尿病已經成為失明、腎衰竭、手足壞死、心臟并發癥等病變的主要原因，世界衛生組織估計，到2025年，糖尿病費用占全球衛生預算的比例將高達13%左右［2］。葡萄糖生物傳感器作為檢測血糖濃度以及診療糖尿病的重要工具，在全球有著巨大市場，其在2010年銷售額超過100億美金，并且逐年增長［3］。目前，糖尿病患者主要采用第2代手持式血糖儀進行個人檢測，II型糖尿病人每天至少需要測2次，I型糖尿病人每天需要檢測4次來判斷血糖的波動趨勢，這種方式相對簡便、廉價，但無法掌控血糖波動變化規律，特別是不可預測由低血糖昏迷導致的患者死亡。因此，對糖尿病患者血糖濃度進行連續監測被國際學術界普遍認為是最佳診療方式，特別適合對胰島素嚴重依賴的I型糖尿病患者［4-5］。

目前研究以及市場上出售的微創型傳感器主要是針式（Needle type）器型［5-6］，這種器型設計的優點是創傷小、可以最大限度地減少器件植入生物體后出現的纖維包膜問題，但缺點也顯而易見：葡萄糖氧化酶（GOD）只能薄薄地沉積在管壁周圍，導致此類傳感器使用周期較短（小于一周）。為了解決GOD擔載低的現狀，Medtronic公司曾經報道了基于MEMS工藝的硅基多孔道微結構，用于擔載大量GOD，并且每個孔道都可以獨立使用，起到一種緩釋效果來延長傳感器使用壽命。即使這款傳感器的設計參數沒有公開，但作者認為該技術成本過高，且硅片器件易對植入創口周圍組織產生損傷。

螺旋型鉑銥合金電極最早由美國Moussy教授課題組提出，采用螺旋型鉑銥合金電極來擔載GOD，與上述針式結構相比，該器型螺旋孔道結構可以擔載更多酶，可以延長了器件植入后的使用壽命［7-8］。本論文的重點是對螺旋型鉑金電極進行優化，通過研究不同酶配方、滴涂厚度以及不同PU含量對傳感器的穩定性、使用重復性的影響，以期待獲得性能最佳的植入式葡萄糖生物傳感器。

1　實驗

1.1實驗試劑

葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，GOD）、牛血清蛋白（Bovine serum protein，BSA）、戊二醛（Glutaral?dehyde，GA）、聚氨酯（PU）、抗壞血酸（Ascorbic acid，AA）、尿酸（Uric acid，UA）、四氫呋喃（Tetrahydrofu?ran，THF）、十二烷基聚四氧乙烯醚（Brij30）、雙組份環氧膠粘劑（Epoxy）等化學試劑均從Sigma-aldrich公司購得，實驗用水為18 MΩ·cm超純水。

1.2螺旋鉑金電極的制備

采用螺旋型鉑金電極的傳感器示意結構如圖1所示。主要包括Pt-Ir線圈型工作電極、GOD、選擇性半透膜等。

圖1　螺旋電極示意圖

1.2.1鉑工作電極的制備

取長約4 cm~7 cm的醫用級鉑銥絲（Φ0.125 mm，Pt∶Ir=9∶1），剝離去除末端1 cm左右的Teflon涂層，在超純水中超聲處理5 mins。用無水乙醇擦拭的鑷子將上述鉑銥絲沿著皮下注射針頭（30 gauge）緊密盤旋纏繞5圈~8圈，獲得外徑約為1 mm，內徑約為0.85 mm的Pt-Ir線圈。將一小股纖維材料嵌入線圈內，用以提高GOD固定載量。

1.2.2GOD溶液的制備與涂覆

采用經典的化學交聯的方法，以GA為交聯劑，將GOD與BSA配制成氧化酶溶液，并在搖床上使其均勻混合。本實驗采用兩種不同GOD配比的酶配方，分別記作GOD-1/Epoxy-PU和GOD-2/Epoxy-PU電極。將前文所述的電極垂直懸掛在可移動膠帶上，用10 μL的移液槍移取8 μL酶溶液滴涂到電極上面兩次，其中滴涂前后間隔為30 mins，然后讓修飾電極在室溫環境下干燥1 h。

1.2.3Epoxy-PU［9-10］半透膜的制備與涂覆

將4 mL THF，26.7 mg的PU，1 mg Brij30及Epoxy按比例配置成Epoxy-PU溶液。將制備好的螺旋線圈型酶電極，垂直懸掛在可移動膠帶上，使用10 μL的移液槍分別移取2 μL、4 μL和6 μL和Epoxy-PU溶液，滴涂到不同酶電極上。將修飾Epoxy-PU的酶電極放置在室溫下干燥30 mins，然后放置在80℃恒溫干燥箱中固化20 mins。制備完成的電極，置于0.15 mol/L的PBS緩沖溶液中，并在4℃環境下冷藏。

1.3實驗測試

實驗采用CHI660D電化學工作站（上海辰華）的三電極體系：其中自制的鉑銥螺旋線圈電極為工作電極，Pt絲為對電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極。在自制的聚四氟乙烯電化學反應池中，以PBS緩沖溶液作為支持電解質，加入適量葡萄糖溶液，用循環伏安法和計時電流法的電化學表征方法對所制備的電極進行測試。循環伏安測試是在靜態溶液中進行，電位范圍是0.2 V~ 0.8 V（vs. SCE），掃描速率為50 mV/s；計時電流測試的控制電位為0.7 V，同時在磁力攪拌的電解池中進行。選用S-4800型場發射掃描電鏡（日立）觀測半透膜的形貌，采用1.0 kV的操作電壓、2 kV的加速電壓和1 μA的電子束電流的Schottky輻射源。

2　結果與討論

2.1PU含量的影響

本文考察不同Epoxy-PU半透膜厚度對傳感器性能的影響，首先在螺旋電極（配方1）外層分別涂覆2、4和6 μL的Epoxy-PU溶液，然后將電極置于8 mL PBS底液中，工作電位為0.7 V，考察電極對2 mmol/L~30 mmol/L之間7個不同葡萄糖濃度的響應電流-時間曲線，如圖2所示。

圖2　GOD-1/Epoxy-PU電極對不同葡萄糖濃度的計時安培電流響應曲線

從圖2可以看出，當滴涂2 μL Epoxy-PU時，在2 mmol/L~30 mmol/L之間的電極響應都呈現出標準的飽和曲線臺階，并在整個測量范圍內實現良好的線性度。相比于滴涂4 μL Epoxy-PU的修飾電極，當溶液中葡萄糖濃度增加到20 mmol/L時，電流響應達到最高值后便開始逐漸下降。相比于滴涂6 μL Epoxy-PU、葡萄糖濃度達到15 mmol/L時，響應電流達到最高值后便出現驟降且下降幅度也較涂覆4 μL Epoxy-PU的電極大。在本研究中，PU作為一種多孔聚合物半透膜，它可以起到篩分作用，能限制外部溶液的葡萄糖分子進入傳感器從而提高傳感器的線性響應范圍。但是，當其厚度達到一定值時（如4 μL Epoxy-PU），不僅會限制外部溶液的葡萄糖分子進入，還限制了葡萄糖分子通過半透膜進入傳感器的傳遞速度。從而使得檢測范圍減小，以至于線性響應范圍大幅下降。因此，涂覆2 μL Epoxy-PU溶液所得半透膜層性能最佳。

圖3為GOD-1/Epoxy-PU電極在5 mmol/L葡萄糖溶液中不同掃速下的循環伏安曲線（a）以及電極的峰電流與掃速之間的線性關系圖（b）。如圖3（a）所示，隨著掃速的增加，GOD-1/Epoxy-PU電極的氧化峰電流逐漸增加。通過對曲線的峰電流值進行擬合，所得方程如下：

Ipa=869.933+19.81v（1）

其中，I表示響應電流；v表示掃描速率。由圖3（b）可知，氧化峰電流與掃描速率呈現出良好的線性關系，表明GOD-1/Epoxy-PU電極對葡萄糖的電催化氧化反應是一個典型的表面控制過程的電化學行為。

圖3　不同掃速時循環伏安圖和電極峰電流與掃速線性關系圖

我們在原有Epoxy-PU溶液的配方基礎上，改變PU的含量，通過計時安培響應曲線來比較PU含量對電極性能的影響，以確定最優配方。如圖4所示，在螺旋電極外層涂覆2 μL Epoxy-PU溶液，考察溶液中不同PU含量對傳感器性能的影響。以8 mL PBS為底液，工作電位設置為0.7 V，考察2 mmol/L~30 mmol/L之間7個不同葡萄糖濃度的響應-電流時間曲線。由圖4可以看出，隨著PU含量的增加，傳感器對電流的響應也在逐漸減小。PU含量為30.7 mg時，雖然傳感器的響應時間較之前PU含量為26.7 mg的更快（約為100 s），但是，我們可以發現：當滴加量達到15 mmol/L時，電流的響應值已開始顯現出下降的趨勢且線性擬合度也較之前PU含量為26.7 mg稍遜。當PU含量為44.1 mg時，傳感器對于不同濃度的葡萄糖所響應的電流值，已不呈線性關系，所響應的電流值也較PU含量為26.7 mg時所響應的電流值下降了約7倍（按電流最大值計算）。當PU含量高達65.2 mg時，傳感器對于不同濃度的葡萄糖幾乎無響應的電流，這是由于PU濃度過大導致半透膜孔隙率急劇下降，葡萄糖分子透過幾率很低。

圖4　不同PU含量的計時安培電流響應

Epoxy-PU半透膜的顯微結構對葡萄糖分子輸運起到至關重要的作用，該膜層顯微結構的SEM照片如圖5所示，由圖5可知，Epoxy-PU半透膜是一種多孔聚合物，呈現出一系列細小的孔洞，孔徑大致為0.5 μm~1 μm。當用于傳感器半透膜時，它可以起到篩分作用，將一些小分子（UA，AA等）過濾掉，從而提高傳感器的線性范圍。而隨著PU含量的增加，孔隙率急劇降低，它不僅能阻擋一些小分子，還會阻礙葡萄糖分子的通過，這就再次驗證前面所述，當PU含量為65.2 mg時，傳感器對電流幾乎無響應。由此可知，在Epoxy-PU半透膜中，PU最優配方為26.7 mg。

圖5　Epoxy-PU半透膜的掃描電鏡圖

2.2改變酶配方對電流的影響

由圖2可以看出：GOD-1/Epoxy-PU電極所獲得的葡萄糖響應電流在25 mmol/L時高達3 μA，該電流是通過檢測過氧化氫在固定電勢下釋放的電子而測得，可用如下反應式表達［11］：

由上式可知，溶液中葡萄糖被GOD催化氧化的酶促反應過程是需要氧氣參與的，因此氧氣在溶液中的含量對反應有重大影響。在人體皮膚下間質液中，氧的濃度大約是葡萄糖的濃度的三十分之一，所以電流一旦過大，而體內氧氣供給不足，不利于反應的進行，導致響應信號的非線性。為此，我們設計出另外一組氧化酶配比，GOD-2，采用最佳PU含量為26.7 mg的半透膜Epoxy-PU溶液，構建出GOD-2/Epoxy-PU電極。

如圖6是GOD-2/Epoxy-PU電極在8 mL PBS底液中，工作電位為0.7 V條件下，傳感器外層分別涂覆2、4和6 μL Epoxy-PU對于不同濃度的葡萄糖所獲得電流-時間響應階梯曲線。由圖6可知，在該傳感器外層滴加的2 μL，4 μL和6 μL Epoxy-PU時，都成功實現了葡萄糖濃度再2 mmol/L~30 mmol/L生理區間的線性響應。值得關注的是，該電極獲得的葡萄糖響應電流值降到1 μA以內，較GOD-1/Epoxy-PU電極大幅下降，這對于減少氧氣含量的影響，提高電極響應電流的線性度有重要意義。此外，隨著Epoxy-PU滴加量的加大，響應的時間也逐漸增長，滴加2 μL Epoxy-PU時，能在較短的時間內達到平衡，而滴加4和6 μL Epoxy-PU時，響應也隨之減慢。

圖6　GOD-2/Epoxy-PU電極對不同葡萄糖濃度的計時安培電流響應曲線

根據圖6的計時安培電流檢測階梯曲線，得到GOD-2/Epoxy-PU電極在不同PU涂層下對葡萄糖濃度的響應電流，其值如表1所示，相應的電流響應線性擬合圖如圖7所示。從圖表中可以看出，GOD-2/ Epoxy-PU電極在外層分別涂覆2、4和6 μL PU半透膜時，其電流響應的線性擬合相關系數R2分別為98.964%、99.784%、99.938%，表明這三種厚度的PU涂覆都可以獲得良好的響應線性度。我們將傳感器的靈敏度S（單位為nA/（mmol/L））設定為：

其中：I1和I2分別為15 mmol/L和5 mmol/L葡萄糖對應的響應電流值，C1和C2分別為15 mmol/L和5 mmol/L葡萄糖溶液濃度值。從圖7和表1可以得出，GOD-2/Epoxy-PU電極涂覆2、4、6 μL PU半透膜后的靈敏度分別為20.27 nA/(mmol/L)、30.45 nA/(mmol/L)、15.07 nA/(mmol/L)。

表1　GOD-2/Epoxy-PU電極在不同PU涂層下對葡萄糖濃度的電流響應值

圖7　GOD-2/Epoxy-PU電極在不同PU涂層下對葡萄糖濃度的電流響應線性擬合圖

從圖6可以看出，GOD-2/Epoxy-PU電極涂覆2 μL PU、4 μL PU、6 μL PU半透膜后達到穩態電流的時間分別是100 s、150 s、200 s。涂覆6 μL PU時，傳感器的響應時間最長，靈敏度最低。涂覆4 μL PU時，傳感器的響應時間約150 s，靈敏度最大。而涂覆2 μL PU時，傳感器的響應時間最少（約100 s）。相比于涂覆4 μL PU和6 μL PU的電極，2 μL PU涂覆后的電極在2 mmol/L~30 mmol/L葡萄糖生理范圍內，對7個不同葡萄糖濃度的響應電流時間曲線呈現出最為標準的飽和臺階。綜合比較相關性能參數，GOD-2/Epoxy-PU涂覆2 μL PU的電極表現出最佳性能。

2.3傳感器重復性，穩定性和抗干擾性

選用性能最優的涂覆2 μL PU的GOD-2/Epoxy-PU電極，先后測量了三次計時安培電流響應曲線，如圖8所示。從中可以看出，三次測試都能獲得良好的安培電流響應曲線，雖然每次測試時電流響應值有所增加，但對應于每個葡萄糖濃度梯度的電流變化甚小，對葡萄糖濃度達到15 mmol/L測量時其相對標準偏差為7.31%，表明基于該電極的傳感器具有良好的重現性。

圖8　GOD-2/Epoxy-PU電極對不同濃度葡萄糖的三次計時電流響應圖

對所制備的GOD-2/Epoxy-PU電極進行穩定性測試，電極存放在4攝氏度冰箱內，1周后檢測電流響應信號為初始信號的96.1%，6個月之后，響應電流仍可達到初始信號的80%以上。這表明GOD可以很好地固定在Pt-Ir合金螺旋線圈內的纖維材料上，H2O2對其產生的副作用較小，該傳感器滿足長期植入的需求。

Epoxy-PU作為傳感器的高效選擇性半透膜可以規避生物體內某些具有電化學活性干擾物，如：UA，AA。本傳感器的工作電位為0.7 V，在此電位下，UA 和AA容易被電化學氧化［12］，產生干擾電流，從而影響結果。考慮到人體血糖內的葡萄糖濃度至少要30倍高于干擾物濃度，我們將抗干擾實驗設置為分別注入5 mmol/L葡萄糖（glucose，Glu），0.5 mmol/L UA以及0.5 mmol/L AA。如圖9所示，正常生理濃度范圍內的UA（0.5 mmol/L）和AA（0.5 mmol/L），與5 mmol/L的葡萄糖相比僅僅產生可以忽略不計的電流響應，表明GOD-2/Epoxy-PU型螺旋電極對葡萄糖的檢測具有良好的選擇性。

圖9　GOD-2/Epoxy-PU電極的抗干擾性測試

3　結論

本文通過考察PU涂覆厚度、PU含量以及不同酶配方來評估傳感器的性能。首先通過比較兩種不同PU含量Epoxy-PU溶液以及膜層滴涂厚度得到的計時電流響應階梯曲線，研究表明，隨著PU含量的加大，傳感器的響應電流值逐漸減小至幾乎無響應。當滴涂厚度為2 μL，PU含量為26.7 mg時，GOD-1/Epoxy-PU型傳感器表現良好的性能。

為了減少溶液中氧含量缺乏的問題，通過比較兩種不同配比的酶配方，發現GOD-2/Epoxy-PU電極相比于GOD-1/Epoxy-PU電極，響應電流值降到1 μA以內，靈敏度下降到20 nA/(mmol/L）~30 nA/ (mmol/L)之間。此外，GOD-2/Epoxy-PU電極重復性好，長期穩定性佳（6個月后電流響應信號可達初始信號的80%），表明所制備的葡萄糖傳感器是滿足長期植入需求的一款器件。抗干擾性物質（UA和AA）實驗表明：GOD-2/Epoxy-PU型螺旋電極對葡萄糖的檢測具有良好的選擇性。此外，在選擇性半透膜表面涂覆生物相容性水凝膠來進一步減小傳感器植入后的產生纖維包膜的工作正在進行中。

參考文獻：

［1］中國城市人群健康白皮書，中國醫師協會，2010.

［2］Wilson G S，Gifford R. Biosensors for Real-Time in vivo Measure?ments［J］. Biosens Bioelectron，2005（20）：2388-2403.

［3］2011 Annual Report，Global Industry Analysts，Inc.

［4］Dolgin E. Managed by Machine-Artificial Pancreases Promise to Take the Decision-Making out of Managing Type 1 Diabetes［J］. Nature，2012（485）：s6-s8.

［5］Abraham A A，Fei R C，Cote G L，et al. Self-Cleaning Membrane to Extend the Lifetime of an Implanted Glucose Biosensor［J］. ACS Appl Mater Inter，2013（5）：12832-12838.

［6］劉尚，李作，岳瑞峰.基于微針陣列的連續監測葡萄糖傳感器［C］//第十二屆全國敏感元件與傳感器學術會議論文集，2012：455-457.

［7］Yu B，Moussy Y，Moussy F. Coil-Type Implantable Glucose Bio?sensor with Excess Enzyme Loading［J］. FrontBiosci-Landmark，2005（10）：512-520.

［8］Yu B，Wang C，Ju Y M. et al. Use of Hydrogel Coating to Improve the Performance of Implanted Glucose Sensors［J］.Biosens Bio?electron，2008（23）：1278-1284.

［9］Geckeler K，Wacker R，Martini F，et al. Enhanced Biocompatibili?ty for SAOS-2 Osteosarcoma Cells by Surface Coating with Hydro?phobicepoxyresins［J］.Cell Physiol Biochem，2003，13（3）：155-64.

［10］Berruet R，Vinard，Calle A，et al. Mechanical Properties and Bio?compatibility of Two Polyepoxy Matrices：DGEBA-DDM and DGE?BA-IPD［J］. Biomaterials，1987，8（3）：162-71.

［11］Zhu Z G，Garcia-Gancedo L，Moussy F，et al. A Critical Review of Glucose Biosensors Based on Carbon Nanomaterials：Carbon Nanotubes and Graphene［J］. Sensors，2012，12（5）：5996-6022.

［12］Heller A. Implanted Electrochemical Glucose Sensors for the Man?agement of Diabetes［J］. Annu Rev BiomedEng，1999（1）：153-175.

余江淵（1990-），男，碩士研究生，主要從事植入式葡萄糖傳感器的研究，yjy19900422@126.com；

陳云霞（1976-），女，副教授，博士，國家日用及建筑陶瓷工程技術研究中心副主任、江西省“井崗之星”，主要研究方向為納米光電材料和傳統陶瓷材料。主持國家青年基金項目、江西省科技支撐計劃和自然科學基金項目，yx_clouds@126.com。

朱志剛（1977-），男，教授，博士，環境與材料工程學院材料工程系主任、校金橋特聘教授、上海市高校特聘教授“東方學者”，主要研究方向為智能傳感材料與器件。主持國家自然科學基金面上項目、上海科委基礎研究重點項目、上海人才發展基金、教育部留學歸國人員啟動基金等項目，zgzhu@sspu.edu.cn；

Analysis on Electrostatically Actuated Diaphragm Micropumpwith Energy Equilibrium Method*

HU Yuanlin，LIANG Xin，WANG Wen*，ZHANG Yu
（Institute of Refrigeration and Cryogenics，School of Mechanical Engineering，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China）

Abstract：The electrostatically actuated flexible diagram pump is analyzed in this paper，it is modeled with the mod?ified energy equilibrium method considering the kinetic energy of the diagram. Energy variation of the pump is also analyzed here. Compared with the results from the minimum energy method，the calculated pressure rise is 87.08 kPa with actuated voltage 300 V，and the pull-in radius of the diagram on the compression chamber is 4.06 mm，the pressure rise is a few higher than the result with the minimum energy method due to the impact of the kinetic energy of the diagram. With the proposed method，some factors，such as diaphragm thickness，dielectric layer thickness and cavity geometric parameters are discussed on the performance of the flexible diagram pump with double-cavity. Moreover，reducing the diagram thickness and its dielectric layer，decreasing the cavity depth and radius is helpful to improve the pressure rise of the micropump.

Key words：electrostatically actuated micropump；energy equilibrium method；large deformation of round diaphragm

doi：EEACC：8300；834010.3969/j.issn.1004-1699.2016.01.003

收稿日期：2015-04-17修改日期：2015-06-12

中圖分類號：TQ174

文獻標識碼：A

文章編號：1004-1699(2016)01-0009-06

項目來源：上海高校特聘教授（東方學者）計劃項目；國家自然科學基金項目（61471233）；上海市科委基礎研究重點項目（13NM1401300）；上海市曙光計劃項目（14SG52）；上海市人才基金項目（201346）；上海市科委揚帆計劃項目（14YF1410600）；上海市教委晨光計劃（13CG62）