細絲蛋白A與蛋白激酶B在小腸腺癌中的表達與意義

張鴻濱，張朝軍

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細絲蛋白A與蛋白激酶B在小腸腺癌中的表達與意義

張鴻濱，張朝軍

[摘要]目的 探討細絲蛋白A(filamin A，F(xiàn)LNA)和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)在小腸腺癌組織中的表達及其臨床意義。方法 應用免疫組織化學法、逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western印跡法)，檢測56例小腸腺癌組織及正常小腸組織(距腺癌組織邊緣5 cm以上)中FLNA、PKB的表達情況。結果 小腸腺癌組織中FLNA mRNA表達低于正常小腸組織，而PKBmRNA的表達水平高于正常小腸組織(P＜0.05)。小腸腺癌組織中FLNA表達低于正常小腸組織，而PKB的表達水平高于正常小腸組織(P＜0.05)。FLNA、PKB的表達與患者性別、年齡、腫瘤組織學分級無關(P＞0.05)，而與腫瘤淋巴結轉移、臨床腫瘤分期和腫瘤浸潤深度相關(P＜0.05)；Spearman秩相關系數(shù)顯示FLNA與PKB表達呈負相關(r=-0.289，P=0.008)。結論 FLNA、PKB參與小腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，磷脂酰肌醇3-激酶/PKB信號通路的活化可作為臨床潛在治療靶點。

[關鍵詞]小腸腫瘤；細絲蛋白A；蛋白激酶B；磷脂酰肌醇3-激酶；免疫組織化學；逆轉錄-聚合酶鏈反應；蛋白質(zhì)印跡法

[作者單位]100048北京，海軍總醫(yī)院普外科(張鴻濱，張朝軍)

小腸腫瘤的發(fā)病率較低，惡性腫瘤則更為少見，占胃腸道惡性腫瘤的2%～3%[1]。原發(fā)性小腸腺癌發(fā)病率低、預后差，5年總生存率26%～38%。而腫瘤的復發(fā)和遠處轉移是小腸腺癌患者預后不良的主要原因[2-5]。細絲蛋白A(filamin A，F(xiàn)LNA)與肌動蛋白結合從而影響細胞骨架的重塑，在細胞的遷移、侵入行為中發(fā)揮作用[6]，是細胞運動及信號轉導的整合者[7]。蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)能夠調(diào)控細胞周期、生長因子介導的細胞生存、細胞遷移，以及腫瘤細胞的非錨定性生長[8]。PKB/FLNA信號通路在小腸腺癌發(fā)生、發(fā)展過程及預后中的作用目前尚不明確。本研究應用免疫組織化學法檢測FLNA、PKB在小腸腺癌組織和正常小腸組織中的表達情況，并進一步使用逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western印跡法)檢測FLNA、PKB的表達情況；同時，結合臨床資料探討其與小腸腺癌臨床病理特征的關系，以期為臨床小腸腺癌的治療提供新的可能靶點。

1　資料與方法

1.1臨床資料 海軍總醫(yī)院2005年1月—2013 年1月收治的56例小腸腺癌患者手術切除的小腸腺癌組織和正常小腸組織，男性34例、女性22例，年齡35～75歲、中位年齡53.4歲。

1.2方法

1.2.1取材 小腸腺癌組織取自腫瘤中心處，正常小腸組織取自距腫瘤邊緣至少5 cm處。患者均無其他部位原發(fā)腫瘤，術前均未進行放療和化療，所有樣本均經(jīng)2位病理專家閱片證實。樣本取材后，部分置于液氮中保存，供RT-PCR檢測；部分樣本用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋組織，用于免疫組織化學染色。

1.2.2試劑 兔抗人FLNA單克隆抗體購自美國Epitomics公司。鼠抗人PKB單克隆抗體和兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體均購自日本Santa Cruz公司。RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。免疫組織化學檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。3，3′-二氨基聯(lián)苯胺顯色劑購自日本Tiangen公司。總RNA提取試劑和放射免疫沉淀裂解液均購自日本Solarbio公司。PCR引物由上海生物工程技術服務有限公司合成；逆轉錄試劑盒和聚丙烯酰胺凝膠電泳標準指示劑均購自加拿大Fermentas公司。

1.2.3免疫組織化學染色 嚴格按免疫組織化學試劑盒說明書進行操作，2種抗體染色陽性均主要在細胞質(zhì)，即呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。以磷酸緩沖鹽溶液代替一抗進行染色作為陰性對照。

1.2.4結果判定 按照Sun等[9]方法，F(xiàn)INA、PKB陽性細胞的百分比分為4個等級:0分，陽性細胞＜5%；1分，陽性細胞5%～25%；2分，陽性細胞26%～50%；3分，陽性細胞＞50%。染色強度分為:0分，無色；1分，弱陽性(淺黃色)；2分，中度陽性(棕色)；3分，強陽性(黃褐色)。最后得分綜合判斷:陰性為0分；+為1～3分；++為4～6分；+++為7～9分。

1.2.5RT-PCR法 參照日本TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行RT-PCR。根據(jù)生物樣本庫中人源FLNA、PKB和GAPDH的互補DNA全長設計PCR引物。FLNA的上游引物序列為5′-AGCCTCCACGAGACATCATC-3′，下游引物序列為5′-CCAGTGTGTACTCCCCCTTG-3′；PKB上游引物序列為5′-TGGAGTCACTGACACCCTC-3′，下游引物序列為5′-CGGACATCCGCTAAACAGGT-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物序列為5′-GAAGATGGT-GATGGGATTTC-3′。以GAPDH作為內(nèi)參照，以FLNA/GAPDH、PKB/ GAPDH比值來定量。

1.2.6Western印跡法 使用放射免疫沉淀試劑提取細胞中的總蛋白，定量。取蛋白樣品50μg，加入5×上樣緩沖液(體積比4∶1)，煮沸5 min后上樣。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜，將蛋白質(zhì)轉至聚偏二氟化乙烯膜。將膜置于含5%脫脂奶粉的TBST(Tris-Buffered Saline and Tween 20)液中，室溫封閉1 h，加入特異性的一抗(FLNA為1∶2 000、PKB為1∶200、GAPDH為1∶200)-4℃孵育過夜，次日用TBST液洗膜3次，每次10 min。二抗(1∶2 000)37℃孵育1 h。化學發(fā)光法檢測條帶。

1.3統(tǒng)計學處理 應用SPSS 19.0軟件，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用X2檢驗、t檢驗，并采用Spearman秩相關系數(shù)分析小腸腺癌組織中FLNA、PKB表達的相互關系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1檢測 RT-PCR檢測，F(xiàn)LNA mRNA在小腸腺癌組織中的表達水平較正常小腸組織低[(0.296± 0.030)與(0.850±0.130)，t=3.250]，而PKB mRNA在小腸腺癌組織中的表達水平較正常小腸組織高[(0.710±0.107)與(0.239±0.043)，t=3.170]，組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表1、圖1A、圖2A)。Western印跡法檢測，F(xiàn)LNA在小腸腺癌組織中的表達水平較正常小腸組織低[(0.310±0.085) 與(0.711±0.165)，t=3.490]，PKB在小腸腺癌組織中的表達水平較正常小腸組織高[(0.860±0.108) 與(0.196±0.060)，t=2.850]，組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表1、圖1B、圖2B)。

表1　FLNA、PKB及其mRNA在小腸腺癌組織及正常小腸組織中的表達(±s)

表1　FLNA、PKB及其mRNA在小腸腺癌組織及正常小腸組織中的表達(±s)

項 目　　正常小腸組織　　腺癌組織FLNA mRNA　0.850±0.130　0.296±0.030 PKB mRNA　0.239±0.043　0.710±0.107 FLNA　0.711±0.165　0.310±0.085 PKB　0.196±0.060　0.860±0.108

圖1　小腸腺癌組織及正常小腸組織中FLNA及其mRNA表達

圖2　小腸腺癌組織及正常小腸組織中PKB及其mRNA表達

2.2免疫組織化學 FLNA、PKB在小腸腺癌組織中的FLNA的陽性表達定位于細胞質(zhì)，56例小腸腺癌組織樣本陽性表達率為46.4%(26/56)，其中強陽性表達率為17.8%(10/56)、中度陽性表達率為5.4%(3/56)、弱陽性表達率為23.2%(13/56)；正常小腸組織樣本的陽性表達率為87.5%(49/56)，與腫瘤組織樣本比較差異有統(tǒng)計學意義(X2=24.12、P＜0.001，表2、圖3)。PKB的陽性表達定位于細胞質(zhì)，56例小腸腺癌組織樣本陽性表達率為89.3% (50/56)，其中強陽性表達率為51.8%(29/56)、中度陽性表達率為23.2%(13/56)、弱陽性表達率為14.3%(8/56)；正常小腸組織樣本的陽性表達率為30.4%(17/56)，與腫瘤組織樣本比較差異有統(tǒng)計學意義(X2=42.68、P＜0.001，圖4)。

表2　FLNA、PKB在小腸腺癌組織中表達的相關性(例)

圖3　小腸腺癌組織FLNA免疫組織化學染色(×40)

圖4　小腸腺癌組織PKB免疫組織化學染色(×40)

2.3相關性分析 Spearman秩相關系數(shù)分析，F(xiàn)LNA 與PKB在小腸腺癌組織中的表達呈負相關性(r= -0.289、P=0.008，表2)。

2.4蛋白表達與臨床病理資料的關系 56例小腸腺癌組織中，F(xiàn)LNA、PKB陽性表達與患者年齡、性別、腫瘤組織學分級無關(P＞0.05)，而與淋巴結轉移(X2FLNA=16.468、PFLNA＜0.001，X2PKB=6.550、PPKB＜ 0.05)、臨床腫瘤分期(X2FLNA=17.461、PFLNA＜0.001，、腫瘤浸潤深度相關，見表3。

表3　FLNA、PKB在小腸腺癌組織中的表達與臨床病理資料的關系

3　討論

FLNA是細絲蛋白家族的重要成員，具有高度保守的基因結構，表達廣泛，在哺乳動物的生長發(fā)育中起著重要作用。FLNA的二聚體亞基相對分子質(zhì)量為280×103，長約80 nm，包括氨基末端的肌動蛋白結合結構域和由24個串聯(lián)的重復序列形成的人結構域。這個重復序列由含有約30個氨基酸殘基間隔的2個鉸鏈結構組成。2個多肽鏈連接到第24重復序列的羧基端形成一個“V”型的同型二聚體，此結構與FLNA功能[10]相關。FLNA主要分布在細胞質(zhì)中，棒狀分子結構域形成的β-折疊片層結構為蛋白質(zhì)之間相互作用提供了界面，可與多種具有重要功能的蛋白質(zhì)相互作用。其作為一種細胞膜分子受體的信號蛋白，是一種重要的信號轉導支架蛋白，參與細胞增殖、黏附、遷移[11-12]，以及腫瘤發(fā)生、發(fā)展[13]和器官發(fā)育的調(diào)控[14]。目前，有關FLNA與癌癥的發(fā)生和發(fā)展關系研究較少。本研究中，采用RT-PCR、Western印跡法、免疫組織化學染色對小腸腺癌組織和正常小腸組織進行定位及定量檢測，結果顯示FLNA及其mRNA在小腸腺癌組織中的表達水平均低于正常小腸組織，這一結果與FLNA在正常小腸組織中的陽性表達率高于小腸腺癌組織的檢測結果一致，且FLNA的表達與患者的性別、年齡以及腫瘤的分化程度無關，而與臨床腫瘤分期、淋巴結轉移和腸壁浸潤深度具有相關性。說明FLNA可抑制小腸腺癌的發(fā)生，在病理狀態(tài)下呈低表達，同時FLNA的表達水平與腫瘤的侵襲力呈負相關，對小腸腺癌的侵襲轉移具有阻遏作用。Zhu等[15]發(fā)現(xiàn)FLNA調(diào)控Ras基因/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和Ras基因/鳥嘌呤核苷酸交換因子1通路，減少細胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-9的水平，抑制細胞外基質(zhì)降解，阻止腫瘤細胞的遷移。Campos等[16]發(fā)現(xiàn)FLNA與Smads蛋白家族之間相互作用，調(diào)控轉化生長因子信號并抑制腫瘤細胞的遷移，然而轉化生長因子信號在不表達FLNA的腫瘤細胞中明顯缺乏。目前，F(xiàn)LNA這一抑制腫瘤的機制還并不清楚。

PKB通路是指由磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)始動的生物信息的傳導，PKB為這一通路的中心環(huán)節(jié)。PKB位于PI3K通路中的下游，可以通過其介導的磷酸化過程調(diào)節(jié)下游分子活性轉導調(diào)控細胞凋亡、細胞周期進程、生長因子介導的細胞生存、細胞遷移，并對端粒酶活性、腫瘤血管的生成以及腫瘤的浸潤、非錨定性生長有一定的促進作用。研究表明，由多種機制導致的PKB失調(diào)是眾多人類惡性腫瘤(胃癌、肺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌和前列腺癌)發(fā)生的特點之一[17-18]。因此，PKB通路在腫瘤的研究中具有十分重要的意義。本研究中，PKB及其mRNA在小腸腺癌組織中的表達水平高于正常小腸組織，PKB在正常小腸組織中的陽性表達率低于小腸腺癌組織，且PKB的表達與患者的性別、年齡以及腫瘤的分化程度無關，而與臨床腫瘤分期、淋巴結轉移和腸壁浸潤深度具有相關性。Leystra等[19]研究的活化PI3K在小鼠小腸增生及晚期腫瘤的表達表明，小鼠的遠端小腸和結腸上皮細胞表達的組成性活化PI3K促使其進展為侵襲性腺癌，并蔓延至腸系膜和鄰近器官。這些腫瘤的組織學特征與人類浸潤性黏液腺癌顯著相似，腫瘤的發(fā)生是通過激活PI3K介導的機制。因此，PI3K/PKB通路的激活、完全活化的PKB可能對小腸腺癌的發(fā)生和發(fā)展起一定的調(diào)節(jié)作用。Zhang 等[20]通過免疫組織化學和熒光定量檢測11例正常小腸組織及53例小腸腺癌組織指出，小腸腺癌中PI3K/PKB信號通路高度活化，提示此通路可作為臨床潛在治療靶點。

本研究結論證實，F(xiàn)LNA及其mRNA在小腸腺癌組織中的表達水平與PKB及其mRNA在小腸腺癌組織中的表達水平呈現(xiàn)相反趨勢，并且兩者在癌組織中的表達水平呈負相關。FLNA是PKB的作用底物，PKB通過調(diào)節(jié)FLNA的磷酸化程度從而影響細胞骨架重構，調(diào)控細胞的遷移[4]。PKB的上調(diào)抑制了FLNA的磷酸化程度，從而加強細胞對細胞外基質(zhì)的降解能力，最終增強了腫瘤細胞的侵襲能力。FLNA與PKB相互作用機制仍有待于進一步研究，有望為抑制腫瘤的侵襲和轉移找到新的途徑。

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·臨床研究·

Expressions of filam in A and protein kinase B in small bowel adenocarcinoma and their significance

ZHANG Hongbin，ZHANG Chaojun
(Department of General Surgery，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

[Abstract]Objective To explore the expression of filamin A(FLNA)and PKB in small bowel adenocarcinoma and to analyze their clinical significance.M ethods Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)，Immunohistochemistry(SP)RT-PCR and Western blotmethod were respectively used to detect the expression of FLNA and protein kinase B(PKB)in 65 specimens of small bowel adenocarcinoma and para carcinoma tissues(5 cm distant to themargin of small bowel cancer and no cancer infitration in microscope).Results The expression of FLNA mRNA was significantly lower in small bowel adenocarcinoma tissues than that in the corresponding normal tissues，while the expression of PKBmRNA was significantly higher in small bowel adenocarcinoma tissues than that in the corresponding normal tissues(P＜0.05).The expression of FLNA protein was significantly lower in small bowel adenocarcinoma tissues than that in the corresponding normal tissues，while the expression of PKB protein was significantly higher in small bowel adenocarcinoma tissues than that in the corresponding normal tissues(P＜0.05).Expression levels of FLNA and PKB were correlated with the TNM staging，lymphnodemetastasis，and the depth of tumor invasion，butwere not correlated with gender，age and the differentiation degree(P＞0.05).Spearman rank correlation coefficient showed that the expression level of FLNA was in positive correlation with the PKB level(r=-0.289，P=0.008).Conclusion The expression of FLNA and PKB proteinsmay be correlated with the occurrence，development of small bowel adenocarcinoma.Highly activated phosphatidylcholine 3-kinase(PI3K)/PKB signaling pathway maybe a potential therapeutic target for treatment.

[Key words]Small bowel neoplasms；Filamin A(FLNA)；Protein kinase B(PKB)；Phosphatidylcholine 3-kinase(PI3K)；Immunohistochemistry；Reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)；Western blot

(收稿日期:2015-12-20 本文編輯:徐海琴)

[基金項目]國家自然科學基金(810370479)

doi:10.3969/j.issn.2095-3097.2016.01.004

[中圖分類號]R735.3+2；Q55.7

[文獻標志碼]A

[文章編號]2095-3097(2016)01-0014-05