果蔬氨基酸成分測(cè)定方法的比較分析

胡家禹， 俞靜芬， 張志祥， 凌建剛*

(1.寧波市惠貞書院，浙江寧波 315016;2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江寧波 315040)

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果蔬氨基酸成分測(cè)定方法的比較分析

胡家禹1， 俞靜芬2， 張志祥1， 凌建剛2*

(1.寧波市惠貞書院，浙江寧波 315016;2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江寧波 315040)

果蔬中富含大量的氨基酸，且部分氨基酸是人類自身無法合成的。測(cè)定果蔬中的氨基酸含量，在植物營(yíng)養(yǎng)分析研究中必不可少。由于測(cè)定方式存在差異，可通過比較分析多種常見蔬菜氨基酸含量測(cè)定方法，探討出更符合當(dāng)前經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)測(cè)定方式，或是改進(jìn)方案，促進(jìn)果蔬生產(chǎn)的進(jìn)一步發(fā)展。

果蔬；氨基酸成分；測(cè)定方法

氨基酸是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，是動(dòng)物體合成蛋白質(zhì)的原料。植物蛋白作為蛋白質(zhì)的一種，是由植物中提取的，其營(yíng)養(yǎng)與動(dòng)物蛋白相仿，且更易于消化[1-3]。大豆、花生和核桃等都富含豐富的植物蛋白，近年來研究發(fā)現(xiàn)，植物蛋白對(duì)人體的健康發(fā)揮著動(dòng)物蛋白無法比擬的作用[4]。同時(shí)，果蔬可溶性蛋白質(zhì)含量也是一個(gè)重要的生理生化指標(biāo)，是果蔬品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。許多可溶性蛋白質(zhì)是植物細(xì)胞的重要組成部分，對(duì)植物的酶活性、抗衰老性、抗病性等都具有不可替代的作用，對(duì)它的測(cè)定在植物營(yíng)養(yǎng)分析研究中必不可少。因此，分析測(cè)定氨基酸的含量是果蔬營(yíng)養(yǎng)成分研究中最重要的項(xiàng)目之一。

目前氨基酸成分測(cè)定主要有凱氏定氮法、氨基酸分析儀測(cè)定和液相色譜法等，在測(cè)定豆類、薯類和谷類植物的蛋白質(zhì)含量等方面應(yīng)用非常廣泛[5]。除此之外，甲醛滴定法、氣相色譜法、紙色譜法和電化學(xué)法等也有一定的應(yīng)用。筆者比較分析了多種常見蔬菜氨基酸含量的測(cè)定方法，探討出更符合當(dāng)前經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)的測(cè)定方式。

1 化學(xué)法

利用化學(xué)方法測(cè)定氨基酸含量，一般是利用化學(xué)試劑與氨基酸發(fā)生顏色反應(yīng)從而判斷被測(cè)物中氨基酸的含量，常用方法有凱式定氮法、雙縮脲反應(yīng)法、茚三酮比色法、考馬斯亮藍(lán)法等。

1.1 凱氏定氮法 凱氏定氮法是通過測(cè)定樣品中總氮的含量，然后根據(jù)蛋白質(zhì)和氨基酸中的氮含量，得知氨基酸、蛋白質(zhì)總量。目前常用的凱氏定氮法有3種，分別是全量法、微量法、改良后的凱式定氮法[5-7]。為了比較其中微量法和改良后的凱式定氮法的準(zhǔn)確度，史瑋等對(duì)同一份大豆樣品進(jìn)行5組平行對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)果顯示，采用改良后的凱氏定氮法測(cè)定大豆蛋白質(zhì)含量自動(dòng)化程度高，標(biāo)準(zhǔn)偏差更小，重復(fù)性更好[8]。

向長(zhǎng)萍等采用凱氏微量定氮法測(cè)定苦瓜的粗蛋白含量時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)測(cè)得的數(shù)據(jù)與其他測(cè)定法相比較而言，準(zhǔn)確度更高[9]。但是凱氏微量定氮法操作步驟復(fù)雜、試劑耗量多、測(cè)定周期長(zhǎng)，會(huì)為試驗(yàn)者帶來許多困擾。賈麗艷等對(duì)自動(dòng)凱氏定氮儀法進(jìn)行了改良，分別測(cè)定了同一份綠豆粉樣本中氨基酸的含量，并收集了相應(yīng)的回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)[10]。研究顯示，改進(jìn)的自動(dòng)凱氏定氮儀法明顯縮短了消化裝置的時(shí)間，從而節(jié)省了人力，同時(shí)，從試驗(yàn)后廢棄物排放含量中可以看出，改進(jìn)后的測(cè)定方法明顯減少了污染氣體的排放。改進(jìn)后的凱式定氮法在一定程度上提高了測(cè)定效率，值得大范圍推廣和使用。

1.2 茚三酮比色法 茚三酮比色法是利用氨基酸在一定pH范圍內(nèi)能與茚三酮生成藍(lán)紫色化合物的原理，實(shí)現(xiàn)對(duì)氨基酸的鑒別。一般可以用比色法定量測(cè)定[11]。

王昂等[12]利用了茚三酮比色法測(cè)定谷氨酸含量，借此試驗(yàn)對(duì)茚三酮比色法的優(yōu)劣進(jìn)行了進(jìn)一步的探究。研究顯示，溶液的濃度、反應(yīng)溫度、時(shí)間等都會(huì)對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)生相應(yīng)的干擾，如當(dāng)谷氨酸濃度在80～140 μg/mL 時(shí)，只有在 90 ℃加熱20 min 以上才可完全反應(yīng)。劉飛飛等[13]探究了不同條件對(duì)茚三酮比色法測(cè)定賴氨酸濃度的影響，主要從溶液pH和顯色劑用量2個(gè)方面深入探究，發(fā)現(xiàn)賴氨酸溶液在pH 6.0處有最大吸光度，顯色劑取1.0 mL時(shí)吸光度同樣達(dá)到飽和狀態(tài)，從而得出結(jié)論：最佳試驗(yàn)條件需要滿足以上2點(diǎn)。這在一定程度上為茚三酮比色法測(cè)定氨基酸做出了巨大的貢獻(xiàn)。王文平[14]在測(cè)定豆芽氨基酸時(shí)對(duì)該方法進(jìn)行了改進(jìn)，向反應(yīng)體系中增加了抗壞血酸濃度，減少了試驗(yàn)中因氨基酸含量不足帶來的影響。茚三酮比色法在測(cè)定果蔬鮮樣的游離氨基酸時(shí)得到廣泛運(yùn)用。

由此看來，利用茚三酮比色法測(cè)定氨基酸類型和濃度時(shí)，需要發(fā)揮其操作簡(jiǎn)單、成本低、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)要掌控好反應(yīng)條件，使試驗(yàn)精度更高。掌握好該方法可以較快地測(cè)得植物蛋白中氨基酸含量，減少檢測(cè)的時(shí)間和操作步驟，更快地達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1.3 雙縮脲法 果蔬經(jīng)研磨后配成相應(yīng)溶液，溶液中的pH、溫度、某些有機(jī)離子含量都有可能對(duì)氨基酸含量測(cè)定產(chǎn)生干擾。蛋白質(zhì)能在堿性環(huán)境中與Cu2+發(fā)生反應(yīng)，生成紫紅色產(chǎn)物，根據(jù)生成物質(zhì)量計(jì)算出蛋白質(zhì)濃度，故使用雙縮脲法可以有效規(guī)避這些因素的干擾[15-17]。此方法應(yīng)用于蛋白質(zhì)測(cè)定已有近百年歷史，它被認(rèn)為是一種較為經(jīng)典的蛋白質(zhì)測(cè)定方法。

劉鄰渭等[18]利用該法測(cè)定了蕎麥蛋白質(zhì)含量，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)溶液中蛋白質(zhì)含量基本相等，說明雙縮脲法精確度較高。他們還發(fā)現(xiàn)這種方法不僅適用于蛋白質(zhì)溶解度高的樣品的總蛋白質(zhì)含量分析，還適用于只需要分析出樣品中高溶解度蛋白質(zhì)的含量。陳寧清等[19]對(duì)比了在使用不同的儀器、校準(zhǔn)物、檢測(cè)試劑情況下雙縮脲檢驗(yàn)蛋白質(zhì)的精度，發(fā)現(xiàn)儀器對(duì)結(jié)果偏倚不大，但是不同的校準(zhǔn)物和檢測(cè)試劑對(duì)測(cè)試結(jié)果影響較大，因此有必要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室狀況篩選相應(yīng)的試劑。

雙縮脲法具有簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，能有效應(yīng)用到蔬菜氨基酸含量測(cè)定中。但是，在選取標(biāo)準(zhǔn)樣品、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，需考慮是否與待測(cè)樣品相同或相近，因此當(dāng)待測(cè)樣品種類多樣時(shí)，不宜用該方法測(cè)蛋白質(zhì)總量。

1.4 考馬斯亮藍(lán)法 考馬斯亮藍(lán)法是蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域中一種新建立的測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法，該方法以考馬斯亮藍(lán)試劑為蛋白質(zhì)染色，最后定量測(cè)得離子的量進(jìn)而計(jì)算出蛋白質(zhì)的量[20-22]。與傳統(tǒng)方法相比，該法具有易操作、更快、更敏捷、受干擾程度低等優(yōu)點(diǎn)。

經(jīng)大量的研究表明，在測(cè)定植物的可溶性蛋白質(zhì)時(shí)，凱式定氮法、雙縮脲法等都存在著一定的缺陷。由于考馬斯亮藍(lán)試劑會(huì)與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成染料復(fù)合物，對(duì)不同物質(zhì)起到分辨作用，因此能較好地排除糖類、甘氨酸、其他化合物干擾，其試驗(yàn)結(jié)果同樣與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線近乎吻合[23-25]。

王文平等[26]對(duì)野木瓜多糖中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定和羅群[22]對(duì)菜籽粕中蛋白質(zhì)含量的定量檢測(cè)均采用考馬斯亮藍(lán)法。這些研究得出，考馬斯亮藍(lán)法能有效測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量，這為植物氨基酸的檢測(cè)提供很好的保障。考馬斯亮藍(lán)法為化學(xué)法測(cè)定蛋白質(zhì)打下了良好的基礎(chǔ)，該方法的使用，也為蛋白質(zhì)工業(yè)做出了巨大的貢獻(xiàn)。通過這種方法，可以更進(jìn)一步地去了解、探究生物蛋白質(zhì)成分。由于這種方法較為簡(jiǎn)單易行，成本較低，具有較廣闊的應(yīng)用前景。

2 物理法

利用蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)測(cè)定蛋白質(zhì)含量，如密度、折射率、紫外吸收、熒光性等，常用的方法有液相色譜法、紫外分光光度法等。與其他方法相比，物理法測(cè)氨基酸含量所需要的精確度更高，但在先進(jìn)儀器的幫助下，也能使得測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確[27]。

2.1 液相色譜法 液相色譜法分離機(jī)理是利用待分離的物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)和吸附能力等親和力的不同進(jìn)行分離的。通過一系列復(fù)雜的物化反應(yīng)，最后實(shí)現(xiàn)對(duì)混合物各組分分離和檢測(cè)。經(jīng)典液相色譜在測(cè)定上存在耗時(shí)長(zhǎng)、效率低的缺點(diǎn)，而高效色譜法比起前者實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化操作，同時(shí)提高了效率[28-31]。

高效凝膠過濾液相色譜法的使用是液相色譜法在蛋白質(zhì)測(cè)定上的又一次突破，王梅等[32]就以此方法對(duì)玉米蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)定，并較為準(zhǔn)確地得出其蛋白酶含量和蛋白酶解產(chǎn)物寡肽的分子量。唐玲玲等[33]為了進(jìn)一步了解高效液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)，歸納、比較了多種蛋白質(zhì)的分離檢測(cè)方法，從而總結(jié)出：高效液相色譜法可以較好地弄清楚蛋白質(zhì)的生理特性，并且該方法具有分離效率高、分析速度快、樣品用量少、靈敏度高、分離和測(cè)定一次完成等優(yōu)點(diǎn)。

在測(cè)定棉籽蛋白中總棉酚與游離棉酚含量試驗(yàn)中，唐輝等[34]用高效液相色譜法測(cè)量了2種蛋白粉含量，發(fā)現(xiàn)回收率為95.3%～101.7%。因此，試驗(yàn)認(rèn)為高效液相色譜法測(cè)定既準(zhǔn)確，又可靠。液相色譜法能普遍運(yùn)用，正是因?yàn)檫@種方法較為快速、方便，因此科學(xué)家們不斷更新、提升液相色譜儀的性能，以推動(dòng)蛋白質(zhì)化學(xué)的發(fā)展。

2.2 紫外分光光度法 紫外分光光度法是利用一定波長(zhǎng)下蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定[35-37]。

花生中含有多種人體必需的氨基酸，如亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸等，而紫外分光光度法能夠精確地測(cè)定這些氨基酸的含量。徐瀾等利用紫外分光光度法測(cè)定色氨酸和酪氨酸，意在檢驗(yàn)紫外分光光度法是否適用該類氨基酸的檢測(cè)。經(jīng)多次測(cè)定，徐瀾等發(fā)現(xiàn)，在有18種不同氨基酸的混合液中，以0.1 mol/L的NaOH為溶媒情況下，在280～310 nm波長(zhǎng)中只有色氨酸和酪氨酸能顯示，通過該方案可以有效測(cè)定色氨酸和酪氨酸的含量。試驗(yàn)還得出，當(dāng)該方法運(yùn)用于復(fù)方氨基酸注射液測(cè)定時(shí)，效果也極其顯著[38]。

董欣等[39]為了提高紫外分光光度法的準(zhǔn)確度，又對(duì)17種不同的氨基酸進(jìn)行了紫外光譜的再測(cè)定，利用不同的溶媒，尋找不同氨基酸的最適波長(zhǎng)。這為氨基酸的研究測(cè)定提供了更可靠的技術(shù)支持。

3 結(jié)語

對(duì)于果蔬而言，不同種類的氨基酸是其生長(zhǎng)發(fā)育中必不可少的成分[40]。如果能夠更加高效、準(zhǔn)確地測(cè)定果蔬中各種氨基酸的含量，或許能為消費(fèi)者提供更多選擇。然而在實(shí)際檢測(cè)果蔬氨基酸含量時(shí)，不同的測(cè)定方法各有利弊。總體來說，需要根據(jù)相關(guān)情況來尋求一個(gè)適合的測(cè)定方法。但這并不意味著按圖索驥進(jìn)行測(cè)量，許多研究者分析比較多種測(cè)定方法，探索、制定出新式測(cè)定方案，為該種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的測(cè)定提供了優(yōu)良的條件。

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Comparison Analysis of Determination Ways for Amino Acid Composition of Fruits and Vegetables

HU Jia-yu1, YU Jing-fen2, ZHANG Zhi-xiang1, LING Jian-gang2*

(1. Ningbo Huizhen Academy, Ningbo, Zhejiang 315016; 2. Ningbo Academy of Agricultural Sciences, Ningbo, Zhejiang 315040)

Fruits and vegetables are rich in amino acid, but some of them can't be synthesized. Determining fruits and vegetables’ amino acid content is essential in plant nutrition analysis. By analyzing and comparing determination ways for amino acid content in several common fruits and vegetables, eventually figured out that there are many new approaches fit to the modern economic production, which promotes the development of production of seasonal fruits and vegetables.

Fruits and vegetables; Amino acid composition; Determination way

寧波市科技新苗培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目；寧波市農(nóng)業(yè)重大重點(diǎn)項(xiàng)目(2013C11007)。

胡家禹(1998- )，男，浙江寧波人，高中生。*通訊作者，副研究員，從事蔬菜保鮮、運(yùn)輸研究。

2016-09-02

TS 207.3

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0517-6611(2016)31-0042-03