右美托咪定對NF-κB信號通路的影響

張 奇，闞紅莉*，劉鐵成

（1.吉林省腫瘤醫院麻醉科，長春 130012；2.吉林大學第二醫院麻醉科，長春 130041）

右美托咪定是一種新型的α2-腎上腺受體激動劑，它在麻醉鎮靜和鎮痛方面的輔助作用已經得到廣泛的肯定，同時它對血流動力學影響比較小也是優點之一。許多報道證實α2-腎上腺受體與免疫細胞增殖和功能調節有關，因此本文主要圍繞NF-κB 信號通路闡述α2-腎上腺受體激動劑右美托咪定能否影響免疫因子的調節和表達。

1 材料和方法

1.1 材料 HEK293T 細胞株，Raw cell 264.7 細胞株，IKbα 多克隆抗體（santa），RT-pcr 試劑盒（takara）等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HEK293T使用DMEM培養基培養，加10% FBS 和1%抗生素，每24 h 換液，48 h 使用胰酶消化傳代，保證細胞有規律的傳代生長和健康的狀態。

1.2.2 reporter assay 使用磷酸鈣轉染方法對HEK293T進行瞬時轉染，24 孔每孔轉染NF-κB reporter 質粒50 ng，2 M cacl2 2.5 μL，2*HBS 20 μL，充分混合后均勻加入每孔內。

1.2.3 RT-pcr TRIZOL 試劑進行總RNA 提取，使用biorad 公司的逆轉錄試劑盒進行cDNA 合成，最后使用TAKARA 公司的SYBR 試劑進行基因檢測。

1.2.4 western bloting Raw cell 264.7 細胞經50 nM 右美托咪定處理以后檢測IKbα 的表達水平。

2 實驗結果

2.1 不同濃度的藥物對HEK293T 細胞的影響 12 孔培養板，每孔1×105，過夜培養18 h 后，用磷酸鈣法瞬時轉染細胞，24 h 后分析基因表達的結果。實驗結果說明隨著藥物劑量的增加HEK293T 細胞內Nf-κB 基因表達出現激活現象，可以間接促進下游的免疫分子的表達和增加。見圖1。

2.2 右美托咪定對Nf-κB 基因mRNA 水平的影響 6孔培養板，每孔3*105，培養14 h 后藥物處理10 h，更換培養基繼續培養48 h，每孔細胞使用1ml trizol裂解，總rna 提取，進行rt-pcr 分析，實驗結果說明高濃度的右美托咪定可以增強Nf-κB 基因mRNA 水平的表達。見圖2。

2.3 右美托咪定對IKBα 表達的影響 Raw cell 264.7細胞在6 孔培養板中培養18 h 后使用不同濃度的Dex 處理10 h，繼續培養24 h 后裂解細胞，去上清做western bloting 分析，結果說明藥物濃度增加促進ikbα的降解，從而間接促進Nf-κB 的活化和入核，激活下游基因的表達。見圖3。

圖1 Nf-κB 基因表達與右美托咪定藥物劑量的相關性

圖2 不同濃度藥物對Nf-κB 基因mRNA 水平的影響

圖3 藥物濃度對Raw cell 264.7 細胞IKBα 表達的影響

3 討論

近年來研究發現α2-腎上腺受體激動劑在淋巴細胞酸右美托咪定近年來作為臨床麻醉中廣泛應用的α2-表面廣泛分布，可以參與調節淋巴細胞的功能。鹽腎上腺受體激動劑，其鎮靜和鎮痛效果以及穩定性已經得到證實。右美托咪定作用于腦和脊髓的α2腎上腺素能受體（α2-AR），與美托咪定相比，本品對中樞α2-腎上腺素受體激動的選擇性更強，對α2-腎上腺素受體的親和力是可樂定的8 倍[1]。通過激動中樞神經系統α2受體最密集的區域：腦干藍斑核（其主要作用是負責調解覺醒與睡眠），進而引發并維持自然非動眼睡眠（NREM）狀態[2]，產生鎮靜、催眠作用，α2c 受體在這一過程中被激動并參與抗焦慮作用。作用機理可能為：1）由百日咳毒素敏感的G 蛋白介導，使神經元細胞超極化來抑制神經元放電，激活K+通道，同時抑制電壓門控式Ca2+通道[1,3]；2）作用于中樞神經突觸前與突觸后α2-AR，抑制去甲腎上腺素（NE）釋放，降低突觸后膜的興奮性[4-6]；3）通過抑制腺苷酸環化酶活性，減少細胞內環磷酸腺苷的生成[7-8]。右美托咪定的鎮痛作用主要是作用于脊髓后角突觸前和中間神經元突觸后膜α2腎上腺素能受體，使細胞膜超極化[9-10]，抑制疼痛信號向腦的傳導。

一些經典的NF-κB 激活因子，如tumor necrosis factor α（TNFα） 、interleukin 1 （IL-1）、lipopolysaccharide （LPS），然而還存在一些非經典的激活因子，如UV-C 和一些化療藥物。經典的激活因子激活NF-κB 非常迅速，1 h 可達高峰，而非經典的激活因子激活NF-κB 則相對較慢。已發現[11]多種可被NF-κB上調的抗凋亡基因，如Bcl-xL、 X-IAP、IAP1、 IAP2、IEX-1L、Bfl-1。

本研究中發現α2-腎上腺受體激動劑右美托咪定可以增強Nf-κB 基因的表達水平，在轉錄水平上我們通過reporter assay 實驗和rt-pcr 實驗證實Nf-κB 基因的表達與右美托咪定的藥物劑量密切相關，在一定范圍內隨著藥物濃度的升高基因表達增強。同時我們在蛋白水平上也證實了Nf-κB 的抑制因子ikbα 隨著藥物濃度的升高降解加速，這也直接證實了藥物濃度升高激活了Nf-κB 和入核，從而進一步激活下游靶分子的表達和影響免疫分子和炎癥因子的水平。當然我們還可以深入研究動物模型中的分子機制，為指導臨床合理選擇藥物打下堅實的理論基礎。