Sox30基因在大鼠睪丸發育中的表達與甲基化分析

馬學翔, 董　嚴, 韓　飛, 李小娜, 時小燕, 陳洪強, 郝翔麟, 劉晉祎

(第三軍醫大學 毒理學研究所, 重慶, 400038)

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Sox30基因在大鼠睪丸發育中的表達與甲基化分析

馬學翔, 董嚴, 韓飛, 李小娜, 時小燕, 陳洪強, 郝翔麟, 劉晉祎

(第三軍醫大學 毒理學研究所, 重慶, 400038)

摘要:目的分析Sox30基因在大鼠胚胎發育以及性腺中的表達和甲基化情況。方法取大鼠胚胎發育不同時期組織、出生后至73 d雌雄大鼠性腺和成年不同組織，利用RT-PCR分析該基因的表達情況。利用亞硫酸氫鈉處理后測序法 (BSP)分析Sox30基因甲基化發生情況。結果Sox30基因在大鼠胚胎發育10.5 d就開始表達；出生后Sos30主要在睪丸中表達，且表達逐漸增加，而在卵巢、子宮中不表達；成年大鼠的腦、心、肝、腎、脾、胰、肺、垂體、腸、肌肉、海馬等組織中該基因低表達或者不表達。Sox30表達受甲基化調控，低表達或者不表達組織中該基因明顯高甲基化。結論Sox30基因表達受到其啟動子區域甲基化調控，成年大鼠中該基因僅在睪丸中高表達，表明該基因與雄性性別發育以及睪丸的功能維持有關。

關鍵詞:Sox30基因; DNA甲基化; 睪丸

SOX 家族是一類SRY相關基因構成的基因家族, 該家族的所有成員均含有一個HMG-box DNA 結合域, 因此屬于核轉錄因子蛋白。該家族成員主要參與一些細胞分化、胚胎發育過程中的一些調控，尤其是在早期發育中有一定的組織特異性，因此被認為是目標特異性的轉錄因子蛋白[1]。

Sox30基因是Sox基因家族H亞族的唯一成員，首先從小鼠和人類中分離得到，基因表達分析結果[2]顯示，Sox30基因表達于雄性性腺的生殖細胞。作者前期研究結果揭示，Sox30是一個與睪丸發育密切相關的重要基因，而且其表達模式受其DNA甲基化變化的調控[3]。然而，Sox30基因是否和大鼠睪丸發育相關以及其表達模式與其DNA甲基化是否存在聯系還不得而知。

本研究對成年大鼠各組織和發育各階段的睪丸中Sox30基因的表達和DNA甲基化進行了系統分析。研究結果顯示，Sox30只在成年大鼠的睪丸組織中大量表達，而在其他組織中不表達或者表達量很低；Sox30基因在睪丸中隨著發育其表達量持續升高，40 d后達到峰值并維持較高表達量；Sox30在成年大鼠各組織和發育各階段睪丸中的表達受DNA甲基化的調控。因此，Sox30是一個受DNA甲基化調控且與大鼠睪丸發育或者功能維持密切相關的重要基因。

1材料與方法

1.1動物及取材

大鼠購自第三軍醫大學大坪醫院，動物在恒定溫度(25 ℃)、50%～60%相對濕度、每天12 h光照/黑暗、水和食物自由采食條件下飼養。將性成熟的雄性大鼠和雌性大鼠于下午合籠，陰道涂片檢查有白色陰栓時，雌性大鼠受孕成功，即為孕期1 d。頸椎脫臼法處死大鼠后用常規方法取大鼠的胚胎、睪丸及其他組織器官，所有組織器官凍存于液氮備用。

1.2基因組DNA和總RNA提取

DNA提取參照Promega公司DNA純化提取試劑盒使用說明書進行，DNA樣品定量后保存在-20 ℃備用。用TRIzol法分別提取組織樣品總RNA，RNA定量后保存于-80 ℃備用。

1.3Sox30亞硫酸氫測序PCR(BSP)測序

DNA樣品使用EZ DNA甲基化修飾試劑盒(Zymo Research，D5005)進行修飾，然后進行PCR擴增。BSP擴增引物序列為: Primer1: 5-AAGGTTTAAAAG ATTTTAATAGATT-3; Primer2: 5-TCTAAACCTTATTCTTAATTACCCC-3; 取1 μL修飾后的DNA進行擴增；PCR擴增條件: 95 ℃ 3 min，95℃ 40 s, 66℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 10個循環，95 ℃ 40 s，58 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 30個循環, 72 ℃ 10 min。PCR產物經2%瓊脂糖電泳證實。將瓊脂糖膠電泳上目的DNA片段切下，按照Omega膠回收試劑盒純化目的片段，并連接入pGEM-T Easy Vector，然后轉染DH5α細菌；參照Omega質粒DNA提取試劑盒提取質粒DNA，進行測序分析。

1.4RT-PCR及核酸凝膠電泳分析

RNA樣品用promega公司的反轉錄試劑盒A5001分兩步法獲得cDNA。取模板cDNA 1 μL，進行PCR反應，加入Sox30基因上、下游引物各1 μL，β-actin內參基因上、下游引物各1 μL，加入TaqDNA聚合酶進行擴增。引物序列為Sox30-F: 5-TTTTTTTTATGGAGAGAGTTAGGT-3; Sox30-R: 5-AAAACAACAACA ACACCTATTCC-3; β-Actin-F: 5-GGAGATTACTGCTGGCTCCTA-3; β-Actin-R: 5-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3。擴增條件: 95℃ 3 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環，72℃ 5 min。PCR產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

2結果

2.1Sox30基因只在成年大鼠睪丸組織中高表達

為了確定Sox30在成年大鼠各組織中的表達情況，作者提取了成年大鼠的16種器官組織的RNA，并進行RT-PCR及核酸凝膠電泳分析。結果表明，在成年大鼠中，Sox30僅在睪丸中高表達，在血液中有少量表達，而在卵巢、子宮、附睪、腦、心、肝、腎、脾、胰、肺、垂體、腸、肌肉、海馬中呈現不表達或極少表達(圖1)。

圖1 Sox30基因在成年大鼠各種組織中的表達分析

2.2Sox30基因隨睪丸發育表達逐漸增強

作者隨后對整個胚胎發育過程中性腺組織Sox30的表達情況進行了檢測。結果顯示，在E8.5(8.5 d胚胎)，E10.5，E12.5，E15.5和E19.5，Sox30處于低量表達狀態；在1D(產后1 d)，4D，7D，10D，15D，20D，40D，60D和73D的卵巢中Sox30處于低量表達或不表達狀態；而在1D，4D，7D，10D，15D，20D，40D，60D和73D的睪丸中Sox30處于高表達狀態，而且隨著發育的進行其表達量持續性升高直到大鼠成年，表明Sox30與大鼠雄性性腺的發育和功能密切相關(圖2)。

(E:胚胎期,d:日齡,♂雄性,♀雌性)圖2 Sox30基因在大鼠發育不同階段的性腺中的表達分析

2.3Sox30在成年大鼠各組織的表達受DNA甲基化調控

為了證明Sox30基因在大鼠各組織中的表達與否和其DNA甲基化有關，作者通過BSP直接測序的方法對成年大鼠中典型一對組織睪丸和卵巢及胚胎時期性腺組織的Sox30基因甲基化狀態進行了檢測。實驗結果表明，Sox30在胚胎時期的性腺組織中一直呈高甲基化狀態，這與之前所測得的Sox30的表達水平吻合。Sox30在大鼠睪丸組織中甲基化程度隨著發育睪丸的發育程度而降低，在大鼠成熟時達到最低(73 d); 而在卵巢組織發育過程中卻呈現持續高甲基化。該結果表明，Sox30基因在成年大鼠各組織中的表達受到DNA甲基化的調控(圖3)。

3討論

人和小鼠的不同細胞和組織器官中的SOX家族表達研究顯示，該基因表達具有組織和時間特異性，其胚胎發育不同時期的表達和突變分析研究還顯示，該基因在神經系統和胚胎發育過程中起到很重要的作用，因此SOX 基因家族成員的研究對于揭示性別決定的分子機制、參與胚胎發育的基因的調控等都有十分重要的意義[4-6]。

作者前期研究發現，Sox30基因在成年小鼠中，僅表達于睪丸組織，推測其可能與雄性發育和睪丸正常功能有關。為了進一步證實這種推測，作者分析了該基因在大鼠發育過程及成年不同組織中的表達情況。結果發現, Sox30基因在成年大鼠中除睪丸外，其他組織中呈低表達或不表達。Sox30基因在大鼠胚胎發育的第10.5～12.5天有一定的表達，而這一時間段恰好是性別決定的關鍵時期，結合后期Sox30在睪丸中表達一直上調到成年個體表達達到最高值的數據，作者不難推測Sox30基因可能在胚胎發育早期參與了雄性性別的決定，而成年個體中則參與了睪丸功能的正常執行。

(實心圓,表示該CpG位點甲基化;空心圓,表示該位點未甲基化)圖3 Sox30基因在成年大鼠組織和發育不同階段性腺組織DNA甲基化分析

大量的研究[7]表明，DNA甲基化在發育過程中起著關鍵的調控作用。作者前期的相關研究也表明，不管是在小鼠胚胎發育和成年組織中，Sox30基因表達均受甲基化調控。作者分析了大鼠胚胎不同時期及成年組織中Sox30基因啟動子區域甲基化情況，發現睪丸中Sox30呈低甲基化

或非甲基化狀態，且甲基化程度隨著睪丸的成熟而降低；在胚胎發育早期、卵巢、子宮和成年其它組織中Sox30呈高甲基化狀態，這都提示Sox30啟動子區域甲基化狀態的調控參與了維持睪丸的正常功能。有一點值得注意的是，在胚胎發育早期，Sox30有一定的表達，但是甲基化分析發現其高甲基化，這可能是由于早期胚胎中，多數細胞中該基因不表達，而僅有雄性生殖器官發生相關的細胞中該基因高表達，這一部分細胞比較少，因此甲基化分析時檢測出的5個樣本均為高甲基化。

總之，在成年大鼠的各個組織器官及胚胎發育過程中，Sox30基因的表達受其啟動子區域甲基化調控，Sox30的高表達于成年大鼠睪丸，說明其可能與睪丸的發育和功能調節相關，是一個值得深入研究的基因。

參考文獻

[1]Jiang T, Hou CC, She ZY, et al. The SOX gene family: function and regulation in testis determination and male fertility maintenance[J]. Mol Biol Rep, 2013, 40(3): 2187. doi: 10. 1007/s11033-012-2279-3.

[2]Osaki E1, Nishina Y, Inazawa J, et al. Identification of a novel Sry-related gene and its germ cell-specific expression[J]. Nucleic Acids Res, 1999, 27(12): 2503.

[3]Han F, Dong Y, Liu W, et al. Epigenetic regulation of Sox30 is associated with testis development in mice[J]. PLoS One, 2014, 9(5): e97203.

[4]Koopman P, Munsterberg A, Capel B. Expression of a candidate sex determining gene cloning mouse testis differentiation[J]. Nature, 1990, 348: 140.

[5]Shiota K, Yanagimachi R. Epigenetics by DNA methylation for development of normal and cloned animals[J]. Differentiation, 2002, 69: 162.

[6]常重杰, 杜啟艷, 邵紅偉. Sox基因家族研究的新進展[J]. 遺傳, 2002(4): 470.

[7]Reik W, Dean W, Walter J. Epigenetic reprogramming in mammalian development[J]. Science, 2001, 293(5532): 1089.

Study on DNA methylation and expression of Sox30 in the development of rat testis

MA Xuexiang, DONG Yan, HAN Fei, LI Xiaona, SHI Xiaoyan,CHEN Hongqiang, HAO Xianglin, LIU Jinyi

(InstituteofToxicology,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing, 400038)

ABSTRACT：ObjectiveTo analyze DNA methylation and expression of Sox30 in embryonic development and sex gland of rats．MethodsThe rat embryos from E8.5 to E19.5, tissues of main organ and sex gland in rats from birth to 73 days were collected．The DNA methylation and expression of Sox30 gene were detected by sodium bisulfite DNA sequencing (BSP) and RT-PCR．ResultsSox30 expression was able to detect in embryos at 10.5 days．The expression of Sox30 increased in the rat testis from birth to early adulthood, while it was not observed in ovary and uterus．Sox30 was low expression or non-expression in ovary, heart, brain, liver, kidney, spleen, pancreas, muscle, intestine, pituitary gland, blood and hippocampus of adult rats．Sox30 expression was regulated by methylation, and methylation of Sox30 was highly expressed in tissues with low expression or non-expression．ConclusionThe tissue-specific expression of Sox30 is associated with its methylation in rats．The stage-specific expression of Sox30 is correlated with its methylation and plays an important role in testis development and gonad function．

KEYWORDS:Sox30 gene；DNA methylation；testis

通信作者:劉晉祎

基金項目:國家自然科學基金項目(81172714)

收稿日期:2015-08-05

中圖分類號:R 339.2

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)01-005-03

DOI:10.7619/jcmp.201601002