益氣活血方藥對缺血性腦損傷保護作用的實驗研究進展**基金項目：國家自然科學基金青年基金(81403288)“基于腦缺血動物模型的“腎通于腦”中醫理論的生物學實質研究”；黑龍江省自然科學基金(QC2015102)“基于腦缺血動物模型的“腎通于腦”中醫理論的生物學實質研究”；黑龍江省政府博士后資助基金(LBHZ13200)“針刺補腎改善性腺切除動物記憶障礙的機制研究”

張雨薇　劉 宏　張 博　李 炎　葉 陽　黃樹明通訊作者：eyllh@163.com

?

益氣活血方藥對缺血性腦損傷保護作用的實驗研究進展**基金項目：國家自然科學基金青年基金(81403288)“基于腦缺血動物模型的“腎通于腦”中醫理論的生物學實質研究”；黑龍江省自然科學基金(QC2015102)“基于腦缺血動物模型的“腎通于腦”中醫理論的生物學實質研究”；黑龍江省政府博士后資助基金(LBHZ13200)“針刺補腎改善性腺切除動物記憶障礙的機制研究”

張雨薇①黑龍江中醫藥大學基礎醫學院 黑龍江 哈爾濱 150040劉 宏①張 博②黑龍江中醫藥大學中藥研究院 黑龍江 哈爾濱 150040李 炎②葉 陽②黃樹明②**通訊作者：eyllh@163.com

[摘要]缺血性腦血管病的發生與諸多因素相關，而中醫則認為“氣虛血瘀”為其主要病機之一。目前，臨床治療多以益氣活血作為本類疾病的基本治療原則，益氣活血法在臨床上被廣泛用于腦缺血的治療，并取得了顯著效果。益氣活血方藥，因其成分的復雜性，顯示多層次、多環節及多靶點的作用優勢。為此，綜合論述近年來的相關文獻，從保護神經元、促神經再生、改善能量代謝、降低興奮毒性以及改善微循環等方面系統總結益氣活血法防治缺血性腦血管病的作用機制，以期為臨床應用提供現代藥理學理論依據。

[關鍵詞]益氣活血；腦缺血；氣虛血瘀

[First-author’s address] Heilongjiang Traditional Chinese Medicine University, Harbin 150040, China.

缺血性腦血管病發病率甚高，致死、致殘及復發率亦高，已成為臨床上常見、多發的危重病之一，倍受醫學界的廣泛關注。益氣活血法是臨床上根據傳統中醫理論而制定的中醫藥治則，對于缺血性腦病展現出不容置疑的療效。本研究從神經血管單元整體保護作用的角度，綜述了益氣活血方藥抗腦缺血作用的實驗研究進展。

1　益氣活血藥對神經元的保護作用

1.1 改善能量代謝

腦缺血后，腦組織內氧化磷酸化過程障礙，致使腦內的能源物質ATP生成急劇減少。依賴ATP啟動的Na+-K+泵主動轉運鈉鉀能力降低，水依靠滲透作用大量進入細胞內，促發細胞毒性腦水腫的發生。因此，腦缺血后盡早恢復血流，增加腦組織中能源物質，改善缺血腦組織能源衰竭的狀態，顯得尤為重要。據報道，補氣藥黃芪甲苷與活血藥“三七”的主要有效成分單用或聯合應用，均可對抗缺血后腦損傷。其機制之一是上調葡萄糖轉運蛋白表達，提高葡萄糖的利用率，促使缺血腦組織內的能源物質量增加，進而改善缺血腦組織的能量代謝[1]。在能量代謝的氧化磷酸化過程中，至關重要的2種酶是琥珀酸脫氫酶及肌酸激酶，其變化可反映三羧酸循環的狀態及能量代謝的情況。研究表明，缺血腦損傷后，琥珀酸脫氫酶活性顯著降低，而肌酸激酶的活性顯著升高，其變化幅度與梗死的范圍有關。益氣活血藥可通過升高琥珀酸脫氫酶活性、降低肌酸激酶活性，改善腦內能量代謝而對抗腦缺血再灌注損傷[2]。

由此可見，益氣活血藥可通過改善能量代謝，對抗缺血后腦損傷。

1.2 降低興奮性氨基酸的神經毒性

在生理情況下，腦內興奮與抑制性氨基酸遞質以平衡的狀態，共同參與神經系統的興奮傳遞功能。當腦缺血發生時，興奮性氨基酸尤其谷氨酸(Glu)通過Ca2+依賴性、Na+依賴性以及Na+非依賴性釋放機制過度釋放，且此時攝取機制衰竭，致使Glu堆積于細胞外液，2種氨基酸遞質的平衡被打破[3]。Glu超強的興奮毒性介導了鈣超載以及鈉水內流等關鍵環節的啟動和執行過程，引發急性神經元水腫，甚至是死亡。研究證實，益氣活血藥可促進缺血再灌注大鼠模型的神經功能修復，其機制是基于對2種氨基酸失衡的調節作用，降低Glu、天冬氨酸的興奮毒性，而提高了甘氨酸、γ氨基丁酸(GABA)的保護作用[4-6]。

Glu的興奮毒性作用是通過谷氨酸受體(GluR)介導，GluR包括離子型的受體[N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)和非N-甲基-D-天冬氨酸受體，AMPA與KA兩類受體都歸屬于后者]、代謝性受體(包括mGluRⅠ、Ⅱ、Ⅲ)，Glu主要作用于中樞分布廣泛NMDA。NMDA受體分為NRI、NR2A-D5個亞單位[3]。在MACO大鼠模型上觀察到，益氣活血藥可下調NR1表達，抑制Glu的興奮毒性，保護缺血后腦組織[4]。此外，益氣活血藥對四血管結扎全腦缺血再灌注模型及雙側頸總動脈結扎缺血性腦損傷模型進行干預后，缺血后腦損傷得到明顯改善，其可能機制是顯著降低了損傷大鼠皮質Glu的含量和下調了NMDA受體活性表達[6-7]。故益氣活血方藥可通過降低興奮性氨基酸的興奮毒性，對抗不同腦缺血模型引起的腦損傷。

1.3 抗凋亡

近年來的研究表明，缺血后腦損傷的發生是多因素綜合引起的級聯反應，而缺血半暗區神經細胞凋亡是主導機制。目前，基于抗凋亡保護缺血腦組織的研究成為熱點，是腦缺血治療研究的新切入點。凋亡是一種主動的程序性死亡過程，主要通過線粒體和死亡受體通路被啟動，通路上的促凋亡及抑凋亡基因雙重調控著凋亡過程[8]。研究發現，益氣活血藥可調節凋亡通路上多個環節的功能蛋白的基因表達，減少缺血半暗帶區神經細胞凋亡，發揮腦保護作用[9]。基于局灶性腦缺血再灌注大鼠模型的研究中證實，益氣活血方藥既可以上調抑凋亡基因Bcl-2的蛋白及基因表達，亦可以顯著下調促凋亡基因Fos、Fas、FasL及caspase-3等蛋白及基因的表達，實現對凋亡通路的調控，減少缺血區周圍的神經細胞凋亡數目，進而減輕缺血后的神經損傷[10-14]。由此可見，益氣活血藥可通過抗凋亡作用，保護缺血腦組織。

1.4 促神經再生

傳統觀點認為，成年哺乳動物腦損傷后，中樞神經系統內神經元難以再生。但是，近期研究發現，特定區域或特殊情況下中樞神經系統內存在由神經干細胞執行的神經元新生功能，這無疑給神經系統損傷后的修復帶來曙光[15]。大量研究顯示，神經細胞遭受缺血這一應激刺激后，通過一系列惡性的級聯反應，造成神經細胞大量丟失，是導致神經功能障礙的關鍵。若能激發腦內具有多種分化潛能的神經干細胞群，增加新生神經細胞數量，彌補缺血損傷后神經細胞的丟失，則可以增加腦卒中患者的治愈率，減少卒中患者的病死率和致殘率。目前，關于藥物對神經再生調節的研究，已在廣泛展開，而益氣活血方藥在促神經再生方面展現了廣闊的前景，期望能為腦缺血的治療帶來新思路[16]。

研究證實，局灶性腦缺血再灌注后的1 d、3 d及7 d不同的時間點，模型組巢蛋白(常被作為未分化狀態多能神經干細胞的標志物，其表達在腦組織遭到缺血等損傷后增加，是反映干細胞增殖情況的重要指標)陽性細胞表達的陽性面積及平均光密度雖有差異，但是明顯高于假手術組，表明缺血可促進干細胞增殖[17]。在MCAO大鼠模型中，補陽還五湯及其拆方可顯著改善模型大鼠運動整合與協調能力，通過BrdU/免疫熒光雙標記及免疫蛋白印跡法進一步證實，補陽還五湯作用的可能機制之一是上調了BDNF和VEGF蛋白的表達，促進缺血半暗區及側腦室下區的干細胞增殖，進而加速了缺血后神經功能的恢復[18]。在氣虛血瘀大鼠模型中，用morris水迷宮實驗檢測大鼠的學習記憶能力，觀察到參芎顆粒可明顯縮短模型大鼠找到水下平臺的潛伏期，其具體機制是增加了新生神經元的數目[19]。糖尿病合并腦缺血大鼠模型中亦證實，活血滋陰方劑參芎玉精顆粒干預21 d后，神經元特異性核蛋白(NeuN)、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)和BrdU雙標記的齒狀核新生神經元的數目增加，新生神經細胞向神經元及神經膠質細胞分化的比率明顯高于模型組[20]。如此，在不同模型上，益氣活血藥均被證實可明顯改善腦缺血后大鼠的認知、運動整合及協調能力，其可能機制之一是上調正向調節因子表達，促進缺血區周邊神經干細胞的增殖、分化，使新生神經元的數目增加。另一方面，亦有研究證實，益氣活血方可下調3種抑制因子勿動蛋白(Nogo-A)、少突膠質細胞髓磷脂糖蛋白和髓磷脂相關糖蛋白的表達，促進神經再生，抗缺血后腦損傷[21-22]。同時，神經干細胞的再生過程可受復雜的信號通路調控。

目前，普遍公認的通路有Notch、細胞外信號調節激酶(ERK)、Wnt/β-catenin等信號通路，尤其Notch通路被認為起關鍵作用。有報道顯示，在局灶性腦缺血模型上，通過基因芯片及免疫組化技術證實，益氣活血方可上調Notch3的蛋白表達、下調Frizzled的蛋白及基因表達，進而調控Notch通路，促神經再生，修復損傷腦組織[23]。此外，離體實驗亦證實，氧糖剝奪和復氧因素處理的培養神經干細胞培養液中，加入益氣活血藥人參和川芎的含藥血清后，BrdU標記的干細胞增殖能力顯著增強，westernblot結果證實，主要機制是上調了ERK、P-ERK的蛋白表達，進而激活了ERK通路[24]。

故在體和離體實驗均證實，益氣活血方藥可通過促神經再生，加速缺血后的神經功能恢復。

2　益氣活血藥對改善微循環的作用

繼發于血供不足引起的缺氧及能量代謝障礙是導致腦缺血損傷的最關鍵的原因，如果不對該危險因素加以控制，會觸發鈣超載，興奮氨基酸釋放、凋亡等一系列惡性的級聯反應，加速腦缺血損傷的進展速度。近年來臨床研究發現，神經系統中皮質下腦室周圍白質、基底節和海馬等區域是對缺血最敏感、最易受損的部位[25]。因此，盡早盡快恢復缺血區理想的灌流，改善神經元賴以生存的微環境，對于挽救缺血區神經元至關重要。

2.1 改善血流變

臨床和實驗研究均表明，絕大多數卒中患者及模型動物血流變指標偏離正常的水平，此因素與卒中的進展過程及預后密切相關[26]。反映血流變的指標主要有全血高切粘度、全血低切粘度、血漿粘度、紅細胞聚集指數、紅細胞變形指數、血沉以及纖維蛋白原濃度等。恢復正常的血流變有助于改善血流的狀態，恢復缺血腦組織理想的灌流。有報道顯示，益氣活血藥可顯著降低全血高、低切粘度、紅細胞聚集指數及纖維蛋白原的含量，以保護缺血腦組織[27]。此外，亦有研究顯示，紅花總黃酮呈劑量依賴性改善MCAO所致腦缺血大鼠的行為學、減少腦缺血區梗死體積，其機制之一是抑制大鼠體內血栓的形成和血小板聚集[28]。

2.2 調節血管的舒縮功能

微循環的灌流量與血管舒縮狀態密切相關，血管舒縮狀態受內皮細胞釋放的諸多血管活性物質調節。目前，有關血管活性物質的研究主要集中在降鈣素基因相關肽(CGRP)、6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)及內皮素(ET)、血栓素B2(TXB2)4種物質。腦缺血后，血漿TXB2/6-Keto-PG1α、ET/CGRP嚴重失衡，導致腦組織的灌流量減少。因此，糾正上述物質失衡是中醫治療腦缺血的一個新靶點。研究表明，益氣活血方無論是預先給予還是損傷后給予，均能顯著提高缺血腦組織PGI2、6-keto-PGF1α、CGRP等擴血管物質含量，降低TXA2、TXB2及ET等縮血管物質的含量，從而調節血管舒縮物質的平衡，抗腦缺血損傷[29-30]。

2.3 促進血管新生

恢復血供是挽救缺血半暗區神經細胞的關鍵，而血管新生是實現血供增加最行之有效的途徑之一。血管新生指新生的毛細血管從已存在的血管側枝中出芽與再塑。在局灶性腦缺血再灌注大鼠模型中，缺血再灌的第3 d、第7 d、第14 d及第28 d不同的時間點，以CD31+標記缺血半暗區的微血管密度，隨著時間的推移，微血管密度呈上升趨勢，14 d達到峰值，28 d下降，說明缺血可促進血管新生[31]。血管新生受諸多種血管生成因子與受體相互作用的調控，目前血管生成因子家族中血管內皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管生成素(Ang-1)、胎盤源性生長因子(PlGF)以及血小板源性生長因子(PDGF)倍受關注。尤其VEGF在血管新生中起關鍵作用，成為研究的焦點因子。有報道顯示，在永久性的MCAO大鼠模型，缺血半暗區的VEGF在缺血后第2～14 d表達持續增高，說明缺血可刺激VEGF的生成，進而促進血管的新生[32]。VEGF促血管新生的過程涉及對信號通路的復雜調控，普遍認為Notch是VEGF發揮作用的最重要通路。研究表明，益氣活血單方或者組方均可顯著降低MACO模型大鼠的神經功能評分、改善缺血腦組織病理形態及縮小腦梗死體積，其可能機制是上調VEGF、bFGF等的基因或者蛋白表達，促血管新生，建立了有效側枝循環[33]。此外，益氣活血方在第1 d、第7 d、第14 d以及第28 d不同的時間點，可使Notch信號通路上的關鍵分子VEGF、VEGFR1及Notch1蛋白和基因表達升高，由此證實，益氣活血藥通過對Notch信號通路調控，促血管新生，保護缺血腦組織[34]。

3　展望

根據傳統中醫治則制定的益氣活血法以多層次、多靶點及多環節的優勢治療腦缺血的療效是毋庸質疑的，體內及體外多項研究均顯示，益氣活血方藥可通過對神經血管單元整體保護作用，對抗缺血后腦損傷，其中包括抗凋亡、促神經再生、改善能量代謝及降低興奮性氨基酸的神經毒性等多種途徑的神經元保護作用，以及包括改善血流變、調節血管舒縮功能、促血管新生等多種途徑的微循環改善作用。益氣活血方藥屬于復方中藥，其成分復雜，作用機制也相對復雜，需要建立起符合中醫證型的有效模型驗證其療效。在未來的研究中應該借助中醫理論與現代神經生物學技術的完美結合，進一步深入探究益氣活血法抗腦缺血的作用機理，以便更好的指導臨床應用，并從祖國的醫藥寶庫中開發出更多機制清楚、療效確切以及劑型適宜的具有自主知識產權的新藥來治療腦缺血損傷。

參考文獻

[1]黃小平,王蓓,邱詠園,等.黃芪甲苷和三七的主要有效成分配伍對小鼠腦缺血再灌注后腦組織能量代謝的影響[J].中草藥,2014,45(2):220-226.

[2]胡建鵬,韓小祥,王健.三種中藥復方對腦缺血再灌注大鼠腦能量代謝相關酶影響的比較研究[J].中國中西醫結合雜志,2007,27(3):231-233.

[3]吳喆,趙宇陽,康秋君,等.谷氨酸代謝變化與腦缺血損傷[J].中國實用醫藥,2008,3(2):101-103.

[4]王業梅,王鍵,胡建鵬.益氣活血方對腦缺血大鼠腦組織Glu、GABA及NR1表達的影響[J].安徽中醫學院學報,2010,29(1):44-46.

[5]邱根全,石秦東,蔡云.益氣活血開竅復方對缺血再灌注腦組織興奮性氨基酸及超微結構的影響[J].西安交通大學學報(醫學版),2002,23(5):489-492.

[6]朱兆洪,丁柱,劉茂才.通脈注射液對腦缺血再灌注大鼠興奮性毒性作用的干預機制[J].廣州中醫藥大學學報,2003,20(3):227-229.

[7]許成勇,黃泉智,張崗,等.參龍健腦膠囊對腦缺血大鼠腦組織谷氨酸及N-甲基-D-天冬氨酸受體表達的影響[J].中國中醫藥信息雜志,2012,19(4):42-46.

[8]Iadecola C,Anrather A.Stroke research at acrossroad:the brain for directions[J].Nat Neurosci,2011,14(11):1363-1368.

[9]高欣,康立源,高秀梅.腦缺血后神經細胞凋亡通路及中藥干預[J].中國中醫藥信息雜志,2007,14(7): 96-98.

[10]趙燕玲,曲友直,王宗仁.芪丹通脈片及拆方對腦缺血再灌注后神經細胞凋亡及Bc-l2蛋白表達的影響[J].中華老年心腦血管病雜志,2006,8(2):133-135.

[11]曲友直,趙燕玲,高國棟.川芎嗪聯合黃芪對腦缺血/再灌注后神經細胞凋亡及Fos蛋白表達的影響[J].中國中西醫結合急救雜志,2006,13(2):123-125.

[12]賴真,李麗珊,程少冰.黃芪加紅花對腦缺血再灌注后神經細胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶-3的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2009,15(2):45-48.

[13]胡建鵬,王鍵,吳文萍.腦絡欣通及其拆方對腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區Fas、FasL蛋白及皮質FasmRNA表達影響的實驗研究[J].中國病理生理雜志, 2007,23(4):720-724.

[14]胡建鵬,王鍵,吳玲,等.腦絡欣通對腦缺血再灌注氣虛血瘀證大鼠皮質、海馬CA1區FADD和Caspase-3蛋白表達的影響[J].中國中醫藥科技,2006,13(1):11-13.

[15]GoldmanS.Stemand progenitor cell–based therapy of the human central nervous system[J]. Nat Biotechnology,2005,23(7):862-871.

[16]王義周,寇爽,劉妍,等.中醫藥促進中樞神經再生的研究進展[J].中國實驗方劑學雜志,2010,16(12):197-199.

[17]陳業,王鍵,唐巍,等.腦絡欣通對局灶腦缺血再灌注大鼠神經干細胞及相關調節因子影響的實驗研究[J].中國中醫急癥,2008,17(10):1415-1418.

[18]曲鐵兵,俞天虹,劉志婷,等.補陽還五湯及其拆方對大鼠腦缺血后神經發生的影響[J].中國中西醫結合雜志,2014,34(3):342-347.

[19]韓輝,吳麗敏,儲丹晨,等.參芎顆粒對腦缺血大鼠海馬神經再生及空間學習記憶的影響[J].天津中醫藥, 2013,30(11):647-651.

[20]韓輝,吳麗敏,韓明向,等.參芎玉精顆粒對糖尿病合并腦缺血大鼠海馬神經再生的影響[J].中西醫結合學報,2012,10(10):1140-1148.

[21]江愛娟,葉銘鋼,王浩,等.補腎生髓方和益氣活血方對腦缺血損傷大鼠Nogo-A、OMgp、MAG蛋白表達的影響[J].中醫藥臨床雜志,2013,25(6):533-535.

[22]郜巒,王鍵,胡建鵬,等.益氣活血法對腦缺血再灌注大鼠MAP-2及NOGO-A蛋白表達的影響[J].遼寧中醫藥大學學報,2013,15(5):23-25.

[23]呂磊,胡建鵬,王鍵,等.益氣活血方和補腎生髓方對腦缺血再灌注大鼠Notch3和Frizzled2mRNA及蛋白表達的影響[J].中國病理生理雜志,2013,9(7): 1171-1174.

[24]韓輝,吳麗敏,方芳,等.人參川芎含藥血清對氧糖剝奪/復氧培養神經干細胞ERK信號通路和增殖、活力的影響[J].中國中西醫結合雜志,2013,33(4): 511-515.

[25]Schbitz WR,SchwabS,Spranger M.Intraventricular brain-derived neuro-trophic factor red-uces infarctsize after focal cerebral ischemia in rats[J].J Cereb Blood Flow Metab,1997,17(5):500-506.

[26]李凈,劉昕,郜巒.益氣、活血、益氣活血法對氣虛血瘀證腦缺血再灌注模型鼠血液流變性的影響[J].安徽中醫學院學報,2004,23(3):35-37.

[27]崔書克,劉成藏,王輝.補氣活血飲對急性腦缺血模型大鼠血液流變學及腫瘤壞死因子A的影響[J].中醫雜志,2010,51(8):743-745.

[28]田京偉,蔣王林,王振華,等.紅花總黃酮對大鼠局部腦缺血及血栓形成的影響[J].中草藥,2003,34(8): 741-743.

[29]張紅,鄧莎,秦大蓮,等.纈沙坦聯合川芎嗪對血管性癡呆大鼠血漿6-keto-PGF1α和TXB2含量的影響[J].四川中醫,2010,28(11):18-20.

[30]張吉仲,彭成,謝曉芳.益智五海膠囊對大鼠血管性癡呆模型中ET、CGRP、TXB2、6-Keto-PGF1α的影響[J].華西藥學雜志,2010,25(2):242-243.

[31]肖慧,谷文萍,楊期東,等.大鼠局灶腦缺血再灌注后Ephrin-B2的表達[J].中南大學學報(醫學版),2014, 39(5):452-457.

[32]姚瑞芹,李林.血管內皮細胞生長因子在缺血性腦損傷中血管新生、神經發生和神經保護的作用[J].中國康復理論與實踐,2007,13(3):208-211.

[33]高紅莉,王德才,曲曉蘭,等.黃芪丹參配伍對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織VEGF和bFGFmRNA表達的影響[J].中藥藥理與臨床,2013,29(5):95-98.

[34]陳懿,葛金文,廖君,等.局灶性腦缺血大鼠VEGF/ Notch1信號分子的表達及腦泰方的調節作用[J].中國老年學雜志,2014,34(20):5784-5786.

Research on progress of protection of Yi Qi Huo Xue Fang Yao against ischemic brain injury/ZHANG Yu-wei, LIU Hong, ZHANG Bo, et al// China Medical Equipment, 2016,13(1):122-126.

[Abstract]The occurrence of ischemic cerebrovascular disease related to many factors, TCM believes that‘qi deficiency blood stasis’ is one of the main pathogenesis. In clinical treatment, yiqi huoxue is as a basic therapeutic principle for this kind of disease, yiqi huoxue method is widely used for treatment of cerebral ischemia in clinic,it has been achievedsignificantresults. Yiqi huoxue fang yao shows action advantage of multiple evel, multiple stage, multiple targets, because of the complexity of its composition. Inthis paper,related literaturesare reviewed in recent years,it systematically summarizedthe action mechanism of yiqi huoxue fa for prevention and treatment of ischemiccerebrovascular disease, from the protection of neurons, promoting the nerve regeneration, improving the energy metabolism, reducing the toxicity of excitement, improving microcirculation ,so as to provide modern pharmacology theoretical basis for its clinical application.

[Key words]Yiqi huoxue; Cerebral ischemia; Qi deficiency and blood stasis

收稿日期：2015-07-11

DOI:10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.01.038

[文章編號]1672-8270(2016)01-0122-05

[中圖分類號]R285

[文獻標識碼]A

作者簡介
張雨薇,女,(1979- ),博士研究生，講師。黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，研究方向：中醫藥對心腦血管病的防治及機理研究。