羥乙基纖維素與再生氧化纖維素止血紗布理化性質的對比研究

劉白璐　史 青　林少輝　郝艷麗　仲 亮　李展韜　鄭明廣通訊作者：zhengmingguang@nkbp.com；bmuxieying@bjmu.edu.cn　謝 英

?

羥乙基纖維素與再生氧化纖維素止血紗布理化性質的對比研究

劉白璐①北京大學藥學院藥劑學系 北京 100191史 青②遼寧諾康醫藥(北京)有限公司 北京 100088林少輝①郝艷麗①仲 亮①李展韜①鄭明廣②**通訊作者：zhengmingguang@nkbp.com；bmuxieying@bjmu.edu.cn謝 英①*

[摘要]目的：研究比較羥乙基纖維素止血紗布(HEC-AHG)和氧化再生纖維素止血紗布(ORCAHG)兩者的理化性質，為臨床應用提供支持。方法：實驗測定HEC-AHG與ORC-AHG兩者的溶解度、溶解速率、pH值、電導率和纖維素酶作用下的降解動力學。結果：HEC-AHG在去離子水和生理鹽水中的溶解度和溶解速率分別為12%～15%和6.5～7.2 mg·ml-1·min-1，明顯高于ORC-AHG0.08%～0.1，4×10-5～64×10-5mg·ml-1·min-1。HEC-AHG的pH值為6～7，在去離子水中的電導率與純水(14 μS/cm)接近，而ORC-AHG的pH值為2～3，具有較高的電導率(250～450(μS/cm)。室溫下HEC-AHG在0.1%纖維素酶作用下降解速率高于ORC-AHG。結論：與ORC-AHG比較，HEC-AHG有更好的溶解性能和較小酸性，降解較快，是一種有前景的新型止血材料。

[關鍵詞]羥乙基纖維素；氧化再生纖維素；溶解度；pH值；電導率；降解速率

[First-author’s address] Peking University's College of Pharmacy, Department of Pharmacy, Beijing 100191, China.

外科手術中常伴有出血發生，選擇適宜的止血材料十分重要。目前臨床常用的可吸收止血材料主要為氧化纖維素和氧化再生纖維素(oxidized regenerated cellulose，ORC)類、纖維蛋白膠、α-氰基丙烯酸酯類組織膠以及殼聚糖等[1]。

ORC由再生纖維素經二氧化氮氧化而得，近10年廣泛應用于臨床。ORC-再生纖維素紗布(ORC-absorbable hemostatic gauze，ORC-AHG)為一種無菌可吸收的編織物，為白色帶淺黃色內襯，有輕微焦糖味，其結構中含有羥基和羧基，止血機制主要來源于羧基與血紅蛋白中鐵離子結合，從而形成棕色膠塊，封閉毛細血管末端止血，而不依賴于生理性止血[2-3]。同時，由于ORC-AHG羧基含量在16%～24%，顯酸性，具有廣譜殺菌性，可降低術后感染[4-5]。有報道表明，ORC-AHG生物降解性較好，在體內一般可在2～4周完全降解[6]。然而近期的研究發現，ORC-AHG在臨床應用方面存在一定的缺憾，如可引起組織壞死，并有可能穿過椎間孔，造成脊髓壓迫[7]；強酸性導致的神經毒性，而引起延遲性下肢麻痹和神經系統疾病等[8]。

羥乙基纖維素(hydroxyethyl cellulose，HEC) 與ORC具有類似的主體結構，均為纖維素衍生物。HEC是一種應用十分廣泛的纖維素醚，在醫藥領域主要用作增稠劑、膠體保護劑、黏合劑、分散劑、穩定劑、助懸劑、成膜劑以及緩釋材料，可應用于局部用藥的乳劑、軟膏、滴眼劑以及口服液、固體片劑、膠囊等多種劑型[9-10]。ORC和HEC的分子結構如圖1所示。

圖1　ORC和HEC的分子結構示圖

目前，HEC應用于止血領域，并申請了一項發明專利，成為一種新型水溶性全吸收纖維素多糖止血醫用新材料[11]。為此，本研究探討羥乙基纖維素紗布(HEC-AHG)的相關理化性質，并與臨床外科上最常用的ORC-AHG進行對比，為止血材料的臨床應用提供數據支持。

1　材料和方法

1.1 材料和儀器

HEC-AHG(批號：14090901，云南德華生物藥業有限公司出品)；ORC-AHG(批號：HDB3001，遼寧諾康生物制藥有限責任公司提供出品)；纖維素酶(Biotopped)，葡萄糖(北京化工廠出品)，3,5-二硝基水楊酸(3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS)(CP，購自華威銳科)，NaOH(北京化工廠出品)，硫酸銅(北京化工廠出品)，酒石酸鉀鈉四水合物(Greagent，購自銀河天虹出品)，苯酚(北京化工廠出品)，無水亞硫酸鈉(北京化工廠出品)。

NDJ-1型旋轉粘度計(上海精密科學儀器有限公司)，DDSJ-308型電導率儀(上海雷磁精科)，XMT615智能PID溫度控制儀(上海任重儀表電器有限公司)，Sartorius PB-10 pH計。

1.2 HEC-AHG和ORC-AHG在生理鹽水中的溶解狀態

將HEC-AHG和ORC-AHG在室溫下，分別在50 ml燒杯中加入30 ml生理鹽水。分別稱取一片HECAHG(300 mg)，1/5片速即沙(30 mg)，放入恒溫后的生理鹽水中。每隔0.5 min振搖一次，靜置，觀察樣品的狀態。

1.3 粘度法測定HEC-AHG溶解度

稱取適量HEC-AHG，加入約5 ml溶劑，配制濃度約為5%的溶液，準確記錄濃度。置于恒溫水浴中達溫度恒定后，用旋轉黏度計測定其黏度。然后加入少量HEC-AHG，充分溶解，記錄其濃度，再次測定其黏度，直至其濃度達到15%左右。溶劑分別為生理鹽水和去離子水，測定溫度分別為37 ℃和25 ℃。每組平行實驗3次，繪制粘度-濃度曲線，根據粘度變化拐點所對應的濃度，確定HEC-AHG分別在37 ℃和25 ℃下在去離子水和生理鹽水中的溶解度。

1.4 電導率法測定ORC-AHG溶解度

稱取適量ORC-AHG，精確稱重W1(g)，置恒溫水浴中達到平衡溫度，加入恒溫的去離子水W0(g)，打表計時。分別于15 min，30 min，1 h，2 h，4 h，6 h，24 h，48 h，96 h，120 h，144 h，168 h，216 h，264 h，288 h，318 h，336 h，360 h和384 h測定電導率，直至電導率不再變化。過濾、干燥至恒重，得到未溶解的ORC-AHG質量W2(g)，根據公式1計算溶解度：

測定溫度分別為37 ℃和25 ℃，每組平行測定3次。ORC-AHG在生理鹽水中溶解度采用同法測定，溶解平衡時間參考去離子水體系。

1.5 HEC-AHG和ORC-AHG的溶解速率

取一片HEC-AHG，準確稱重(m)，加入5 ml溶劑，靜置于恒溫水浴中，觀察其溶解過程和完全溶解所需的時間(t)。取適量ORC-AHG，準確稱重(m0)，加入5 ml去離子水，靜置于恒溫水浴中，用電導率儀監測其溶解過程和達到溶解平衡所需的時間(t)。過濾、干燥至恒重，稱量未溶解ORC-AHG質量(m1)。溶解的ORC-AHG質量m=m0-m1。溶劑分別為去離子水和生理鹽水，恒溫水浴溫度分別為25 ℃和37 ℃。每個樣品平行試驗3次。根據公式2計算溶解速率：

1.6 HEC-AHG和ORC-AHG的pH值及電導率

用去離子水或生理鹽水配制0.6%HEC-AHG溶液，飽和HEC-AHG溶液和飽和ORC-AHG溶液。采用pH計和電導率儀分別測定25 ℃和37 ℃的pH值及其在去離子水中的電導率。每個樣品平行測定3次。

1.7 HEC-AHG和ORC-AHG的降解

1.7.1 降解產物的鑒別

室溫下分別在1%HEC-AHG生理鹽水溶液和飽和ORC-AHG生理鹽水溶液中加入纖維素酶溶液(終濃度為0.2%)，反應120 h。取反應液200 μl，分別加入200 μl斐林A液(NaOH 0.05 g/ml)和200μl斐林B液(CuSO4

0.1 g/ml)。100℃水浴中加熱，觀察顏色變化。以1%葡萄糖溶液為陽性對照，以1%HEC-AHG生理鹽水溶液，飽和ORC-AHG生理鹽水溶液和1%纖維素酶溶液為陰性對照。

1.7.2 DNS法定量測定葡萄糖含量

(1)DNS試劑配制：50 ml蒸餾水中加入0.3 g DNS至完全溶解，45 ℃下加入1.6g NaOH，3 g酒石酸鉀鈉，0.5 g結晶酚，0.5 g無水亞硫酸鈉攪拌溶解，冷卻后用蒸餾水定容至100 ml，靜置7～10 d后使用。

(2)葡萄糖在105 ℃下烘干2 h至恒重，配制1.0 mg/ml、0.5 mg/ml、0.25 mg/ml、0.125 mg/ml、0.0625 mg/ml及0.0313 mg/ml標準葡萄糖水溶液。取標準品2 ml，加入0.5 mL DNS試劑，搖勻后在沸水中放置5 min，取出用流水迅速冷卻，用去離子水定容至20 ml，充分搖勻后靜置20 min。在紫外波長為540 nm處測吸光值A。以A～C作圖，得到葡萄糖含量測定標準曲線。

1.7.3 HEC-AHG和ORC-AHG降解過程的監測

室溫下，用蒸餾水配制3 mg/ml的HEC-AHG和ORC-AHG溶液，分別加入纖維素酶溶液(至其終濃度為0.1%)，加入一半時打表計時，分別在1 min、3 min、5 min、10 min、15 min、30 min、60 min、120 min、420 min、720 min及1560 min時取出1 ml反應液，加熱終止反應。采用DNS法定量測定葡萄糖含量的方法測定葡萄糖濃度。

2　結果

2.1 HEC-AHG和ORC-AHG的溶解狀態

室溫下，HEC-AHG在生理鹽水中迅速吸水，由白色網眼型紗布變為透明凝膠狀，漂浮于液體中(如圖2A所示)。約3 min時，溶液開始變得粘稠，粘度開始增加(如圖2B所示)。約10 min時，凝膠完全溶解，整個溶液成透明狀，具有一定粘度(如圖2C所示)。由此可見，HEC-AHG的溶解過程分為溶脹和溶解兩個過程，溶脹時間約為3 min，溶解時間約為10 min。ORC-AHG在生理鹽水中迅速吸水，由白色網眼型紗布變為絲狀(如圖2D所示)。靜置狀態下，其吸水后逐漸分散于溶液中，成棉絲狀。約3 min時，逐漸分散，未溶解(如圖2E所示)。約10 min后，尚可見白色絲狀物質(如圖2F所示)。

圖2　HEC-AHG和ORC-AHG在生理鹽水中不同時間的溶解狀態示圖

2.2 HEC-AHG和ORC-AHG的理化性質

HEC-AHG溶液粘度隨濃度的變化如圖3A所示。HEC-AHG為易溶型高分子材料，其粘度隨濃度增加而增加，當在低濃度范圍內，其溶解過程為溶脹-溶解，粘度隨濃度變化率較小；當達到其飽和溶解度，粘度隨濃度變化率顯著增加，此時HECAHG不再以溶液形式存在，而是形成了半固體凝膠態。ORC-AHG溶解性能較差，但在去離子水中可發生電離，其電導率隨著ORC-AHG的溶解而增加，當達到溶解平衡時，電導率不再隨時間而增加，如圖3B所示。

圖3　HEC-AHG溶液粘度的濃度變化曲線圖

HEC-AHG或ORC-AHG在25 ℃和37 ℃下分別于生理鹽水和去離子水中的溶解度數據見表1。表中數據顯示，HEC-AHG溶解度明顯高于ORC-AHG，提高了近140倍。ORC-AHG溶解度較小，在不同溫度下以及在不同溶劑中的溶解度無顯著性差異。HECAHG在25 ℃下生理鹽水中的溶解度低于去離子水中的溶解度，可能與高分子的鹽析作用有關；但37 ℃下，兩者無顯著性差異，可能由于溫度升高，溶劑分子的熱運動加強，離子強度的影響不足以改變高分子的聚集狀態，因此溶解度無明顯變化。

表1　HEC-AHG和ORC-AHG的溶解度及方差分析(%)(x-±s)

2.3 HEC-AHG和ORC-AHG的溶解速率

HEC-AHG和ORC-AHG在25 ℃和37 ℃下分別于生理鹽水和去離子水中的溶解速率見表2。表中數據顯示，HEC-AHG溶解速率明顯大于ORCAHG，ORC-AHG的溶解速率僅為HEC-AHG的十萬分之一。分析其原因，HEC-AHG的溶解速率高于ORC-AHG與兩者的分子結構有關(如圖1所示)。HEC-AHG的組成成分羥乙基纖維素中富含乙二醇(CH2CH2O)，醚鍵中的氧原子易于和H2O中的氫原子發生氫鍵相互作用，形成水化層，有助于提高纖維素的溶解速率和溶解度。而再生氧化纖維素由于其多支鏈纖維結構，在水中的溶解速率和溶解度均較低。

表2　HEC-AHG和ORC-AHG的溶解速率(mg/ml·min)(x-±s)

2.4 HEC-AHG和ORC-AHG的pH值

HEC-AHG和ORC-AHG在25 ℃和37 ℃下分別于生理鹽水和去離子水中的pH值見表3。表中數據顯示，HEC-AHG在去離子水、生理鹽水中的pH值在6.13～7.33范圍內，屬于中性。HEC-AHG飽和溶液的pH值略＞0.6%溶液，其濃度提高了20余倍，但pH值無明顯差異，表明HEC-AHG在去離子水和生理鹽水中基本上以分子形式存在。ORC-AHG主要成分為氧化再生纖維素，在水環境下羧基極易電離出H+，而呈現出酸性。ORC-AHG在去離子水和生理鹽水中的溶解度雖然只有0.1%左右，但其溶液pH值為2.5～3.5，呈現出較強的酸性。

表3　HEC-AHG和ORC-AHG的pH值(n=3)(x-±s)

HEC-AHG和ORC-AHG在生理鹽水中的pH值均低于去離子水中的pH值，可能與NaCl的離子效應有關。溶液的離子數目增加，介電常數增加，促進纖維素中-CH2OH中H+的解離。

2.5 HEC-AHG和ORC-AHG的電導率

純水的電導率為1.0 μS/cm，溶液中離子數目的增多，其電導率增加。實驗測得HEC-AHG和ORCAHG在去離子水中的電導率見表4。表中數據顯示，HEC-AHG在水中不電離，其與溶劑的電導率相差無幾。雖然其電導率隨著溫度升高略有增加，但也明顯低于ORC-AHG。

ORC-AHG溶解度＜0.1%，但其電導率高于溶劑約20～30倍，而且隨著溫度的升高，其電導率顯著增加，說明ORC-AHG為離子型高分子材料，在水中易電離。

表4　HEC-AHG和ORC-AHG在去離子水中的電導率(x-±s)

2.6 HEC-AHG和ORC-AHG的降解

斐林試劑是檢測葡萄糖的專一試劑，HEC-AHG 或ORC-AHG在纖維素酶作用下降解產物的顯色如圖4所示。由圖4可見，HEC-AHG主要降解產物為葡萄糖，ORC-AHG無明顯的葡萄糖產生。HEC-AHG 和ORC-AHG原液(未經纖維素酶處理)均無明顯的葡萄糖產生。

DNS法測定葡萄糖的線性方程為A=0.11044 m(mg)-0.00948，R2=0.9993，表明該法可以用于葡萄糖的定量測定。

圖4　HEC-AHG或ORC-AHG的斐林試劑顯色反應示圖

HEC-AHG在纖維素酶催化作用下，先生成葡萄糖，然后發生二級降解，如圖5A所示。在此連續反應中，初期葡萄糖生成速率約為0.015 mg/(ml·min)，達峰時間為30～60 min，峰濃度水平為0.783 mg/ ml，是初始HEC濃度水平的25%～30%，最終葡萄糖濃度水平為0.493 mg/ml，是初始HEC濃度水平的15%～20%。由此可見，葡萄糖是HEC-AHG代謝過程中的中間產物，生成葡萄糖的反應速度較快，而葡萄糖進一步轉化的速率較慢。HEC-AHG主要成分羥乙基纖維素屬于纖維素類，纖維素酶可作用于HEC鏈末端，釋放葡萄糖或纖維二糖，葡萄糖可能會進一步轉化。

ORC-AHG在纖維素酶的催化作用下緩慢降解，在其降解曲線上，未發現葡萄糖的二級降解反應，如圖5B所示。該降解反應初期葡萄糖生成速率為(3.57×10-4)mg/(ml·min)，后期為(4.54×10-6)mg/ (ml·min)。ORC-AHG降解速率明顯低于HECAHG。有研究表明，ORC-Na在體內的降解與血液弱堿性pH值有關[12]。ORC中C2和C3氧化形成羰基，由于烯醇化作用形成醇式結構，使附近的葡糖苷發生β-消除，然后在巨噬細胞和水解酶的作用下，低聚糖進一步降解，經新陳代謝轉化為葡萄糖和葡萄糖醛酸的鈉鹽。由于正常生物體內缺乏纖維素酶，HECAHG和ORC-AHG的生物降解尚需進一步研究。

圖5　HEC-AHG和ORC-AHG降解反應中產生的葡萄糖含量與時間關系示圖

3　結論

HEC-AHG與ORC-AHG具有類似的纖維素結構，但在理化性質中存在較大差異。HEC-AHG與ORC-AHG比較而言，具有更好的溶解度和溶解速率，溶解后具有一定的粘度，有利于傷口的粘合，而且在止血后不用取出，能夠生物降解，提高了患者的依從性。此外，HEC-AHG的pH值接近中性，不發生電離，以中性分子形式存在，臨床使用中HEC-AHG對傷口的刺激性小，不會產生神經刺激，具有更廣闊的應用前景。

參考文獻

[1]張少峰,洪加源.醫用生物可吸收止血材料的研究現狀與臨床應用[J].中國組織工程研究,2012,16(21):3941-3944.

[2]Alkan A,Inal S,Yildirim M,et al.The Effects of Hemostatic Agentson Peripheral Nerve Function:An Experimental Study[J].J Oral Maxillofac Surg,2007,65(4):630-634.

[3]于美麗,杜智.可吸收止血材料的研究現狀及臨床應用[J].北京生物醫學工程,2008,27(2):208-213.

[4]Yadong Wu,Jinmei He,Weilu Cheng,et al. Oxidized regenerated cellulose-based hemostat with microscopicallygradient structure[J]. Carbohydr Polym,2012,88(3):1023-1032.

[5]彭承宏.肝切除術中肝臟創面保護和再生氧化纖維素應用[J].中國實用外科雜志,2014,34(8):780-782.

[6]王春,董思遠,谷天祥,等.骨蠟與再生氧化纖維素材料在老年女性心內直視術胸骨止血中的應用[J].中國組織工程研究與臨床康復,2011,15(21):3905-3908.

[7]周維.可吸收止血材料安全性評價的技術要求[J].中國藥理學與毒理學雜志,2013,27(3):532-533.

[8]Pampu AA,Yildirim M,Tüzüner T,et al. Comparison of the effects of new folkloric hemostatic agent on peripheral nervefunction:an electrophysiologicstudy inrats[J].Oral surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol,2013,115(4):e1-6.

[9]趙明,邵自強,敖玲玲.羥乙基纖維素的性能、應用與市場現狀[J].纖維素科學與技術,2013,21(2):70-79.

[10]張光杰,王大林,劉明孫,等.藥用輔料應用技術[M].北京:中國醫藥科技出版社,1991:325.

[11]鄭穎,鄭明義,吳遷,等.羥乙基可溶性止血紗布的止血性能及安全性實驗研究[J].西南國防醫藥,2009(1):13-15.

[12]Muench TR,Kong W,Harmon AM.The performance of a hemostatic agent based on oxidized regenerated cellulose–polyglactin 910 composite in a liver defect model in immunocompetent and athymic rats[J].Biomaterials, 2010,31(13):3649-3656.

Research on physical and chemical properties of hydroxyethyl cellulose hemostatic gauze compared to oxidized regenerated cellulose hemostatic gauze/LIU Bai-lu, SHI Qing, LIN Shaohui, et al// China Medical Equipment,2016,13(1):114-118.

[Abstract]Objective: To compare the physical and chemical properties of Hydroxyethyl celluloseabsorbable hemostatic gauze (HEC-AHG) and oxidized regenerated celluloseabsorbable hemostatic gauze (ORC-AHG) and provide support for clinical application. Methods: To test the solubility, dissolution rate, pH, conductivity and the degradation kinetics under cellulase enzyme. Results: The study shows that the solubility and dissolution rate of HEC-AHG(12%~15%, 6.5~7.2 mg·ml-1·min-1) are higher than that of ORC-AHG(0.08%~0.1%, 4×10-5~64×10-5mg·ml-1·min-1). The pH value of HEC-AHG is 6~7, and the conductivity of HEC-AHG is close to pure water (14 μS/cm). While ORC-AHG has the pH value of 2~3 and has higher conductivity (250~450 μS/cm). In the room temperature, the degradation rate of HEC-AHG is higher than that of ORC-AHG decomposed by cellulase enzyme. Conclusion: Compared to ORC-AHG., HEC-AHG has better solubility, dissolution rate, pH and degradation that indicated HEC-AHG’s potential hemostatic materials.

[Key words]Hydroxyethyl celluloseabsorbable; Oxidized regenerated celluloseabsorbable; Dissolubility; pH value; Conductivity; Degradation rate

收稿日期：2015-07-02

DOI:10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.01.036

[文章編號]1672-8270(2016)01-0114-05

[中圖分類號]R318.08

[文獻標識碼]A

作者簡介
劉白璐,女,(1992- ),碩士研究生。北京大學藥學院藥劑學系，研究方向：新型藥物載體。